Wir möchten Shreya Shah für ihr Korrekturlesen und ihren Rat danken.

1. Doppler Phantom Vorbereitung Setup (Abbildung 2A)
<ol><li>Verbinden Sie die peristaltische Pumpe, das Blut imitierenden Flüssigkeitsreservoir, den Pulsdämpfer und das Doppler-Flow-Phantom mit den Kunststoffröhren.</li>
	<li>Wählen Sie den Kanal mit einem Durchmesser von 4 mm.</li>
	<li>Programmieren Sie die Pumpe, um 720 ml/min Flüssigkeit für 0,3 s auszuwerfen und dann 50 ml/min für 0,7 s auszuwerfen, um die Systole- und Diastole-Herzphasen zu imitieren</li>
	<li>Führen Sie die Pumpe und schütteln Sie sanft die Rohre, um potenzielle Luftblasen zu vertreiben. HINWEIS: Der Bediener kann einen anderen Kanaldurchmesser und eine andere Pumpenrate wählen, muss jedoch sicherstellen, dass die Ultraschallsequenz schnell genug ist, um die schnellsten Strömungsgeschwindigkeiten zu erreichen. Eq. 3, das später vorgestellt wird, kann helfen, die Sequenz zu entwerfen.</li>
</ol>2. Ultraschnelle Ultraschall-Scanner-Setup (Abbildung 2A)
<ol><li>Schließen Sie den ultraschnell-fähigen Forschungsscanner mit dem PCI-Express-Link an den Hostcomputer an.</li>
	<li>Ändern Sie den Geberadapter am Ultraschallscanner entsprechend dem Sondenstecker, und schließen Sie dann den Prüfpunkt an.</li>
	<li>Führen Sie Matlab aus und aktivieren Sie die Ultraschallscanner-Lizenz. HINWEIS: In diesem Abschnitt und im folgenden Abschnitt wird implizit von der Verwendung eines Verasonics Vantage-Systems ausgegangen.</li>
</ol>3. Ultraschall-Sequenzprogrammierung
<ol><li>Entwerfen Sie anhand der Beispiele Skripte eine konventionelle fokussierte "B-Mode"-Sequenz (d. h. Echographie), die für die Sondenpositionierung verwendet wird.<ol>
<li>Stellen Sie die Bildtiefe auf 50 mm ein.</li>
		<li>Stellen Sie die Brenntiefe auf 35 mm ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Entwerfen Sie anhand der Beispiele Skripte eine ultraschnelle Ultraschallsequenz.<ol>
<li>Stellen Sie die Bildtiefe auf 50 mm ein.</li>
		<li>Programm 3 neigte Flugzeugwellen bei [-3,0,3] Grad.</li>
		<li>Stellen Sie die Pulswiederholungsfrequenz (PRF) auf 12 kHz ein.</li>
		<li>Verwenden Sie 4 Halbzyklen für die Ultraschall-Wellenform, mit einer Mittelfrequenz abhängig von der verwendeten Sonde. Hier wird eine Mittelfrequenz von 5,2 MHz angenommen.</li>
		<li>Legen Sie die Gesamtdauer auf 1 s fest.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Sondenpositionierung und Datenerfassung
<ol><li>Ultraschallgel auf die Linse der Sonde auftragen.</li>
	<li>Legen Sie die Sonde auf das Phantom und starten Sie die B-Mode Ultraschallsequenz.</li>
	<li>Finden Sie den Kanal von Interesse. Die Flüssigkeit erscheint dunkler als das umgebende Gewebe. Platzieren Sie die Sonde in der Längsansicht.</li>
	<li>Halten Sie die Sonde manuell in der Position des Interesses.</li>
	<li>Beenden Sie die B-Mode-Sequenz und starten Sie das ultraschnelle Sequenzerfassungsskript.</li>
</ol>5. Bildrekonstruktion (Abbildung 2B)
<ol><li>Sobald die Sequenz vorbei ist, speichern Sie die Rohdaten (auch Als Hochfrequenzdaten ,RF" bezeichnet).</li>
	<li>Starten Sie das Bildrekonstruktionsskript mit der Standardsoftware des Ultraschallsystems. Am Ende des Prozesses sollte die IQ-Datenmatrix erstellt werden. HINWEIS: Die Ultraschallechos werden auf jedem Element der Sonde und für jede Emission/Empfang aufgezeichnet und dann in der HF-Datenmatrix gespeichert. Die Bildrekonstruktion wendete auf jeden Kanal das entsprechende Delay-Gesetz an und ergibt die sogenannte "IQ"-Matrix (In-Phase/Quadrature). Die komplexe IQ-Matrix hat drei Dimensionen: zwei für Raum (Bildtiefe und -breite) und eine für Zeit</li>
</ol>6. Clutterfilterung (Abbildung 2C)
HINWEIS: Die Schritte 6-7 finden Sie im Matlab-Skript im Ergänzenden Material.
<ol><li>Umformen Sie die 3D-IQ-Matrix (Raum x Raum x Zeit) in eine 2D-Casorati-Matrix (Raum x Zeit) mit dem Namen IQr.</li>
	<li>Berechnen Sie die Singularwertzerlegung15 von IQr (Eq. 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ01v3.jpg"> Eq. 1</li>
	<li>Berechnen Sie die räumliche Ähnlichkeitsmatrix C unter Verwendung der räumlichen Singularvektoren U, wie von Baranger et al.18 (II, D) beschrieben, und identifizieren Sie die Blutunterraumgrenzen N.</li>
	<li>Verwenden Sie diesen Cutoff N, um die IQ-Daten zu filtern, wie in Demene et al.15 (II,C) beschrieben.</li>
</ol>7. Strömungsvisualisierung und Geschwindigkeitsmessungen (Abbildung 2C)
<ol><li>Rechenleistung Doppler-Map PD durch Integration der Hülle der gefilterten Daten IQt entlang der zeitlichen Dimension (Eq. 2). Die 3D-Koordinaten z, x und t sind die Tiefe, Breite und zeitliche Dimension, nt und die Anzahl der erfassten Frames. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ02v5.jpg"> Eq. 2</li>
	<li>Zeigen Sie die PD-Karte im Logarithmusmaßstab an. Um den Dynamikbereich festzulegen, berechnen Sie die mittlere PD in einem Bereich außerhalb des Kanals, und verwenden Sie diesen Wert in dB als untere Grenze des Dynamikbereichs. Ein typischer Dynamikbereich ist [-30, 0] dB.</li>
	<li>Definieren Sie einen kreisförmigen Bereich von Interesse (ROI) auf dem Bild, der 1 bis 30 Pixel enthält.</li>
	<li>Durchschnittlich das IQf-Signal über die Pixel dieses ROI, um einen Vektor <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ03v2.jpg"> von nt Zeitpunkten zu erhalten.</li>
	<li>Berechnen und anzeigen Sie das Doppler-Spektrogramm von <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ04v2.jpg"> , mit der quadratischen Größe der Short-Time Fourier Transform (STFT).<ol>
<li>Stellen Sie das STFT-Fenster auf ein 60-Samples-Hann-Fenster ein.</li>
		<li>Legen Sie die STFT-Überlappung auf 90 % der Fensterlänge fest.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Überlagern Sie die Mittenfrequenz an jedem Zeitpunkt des Spektrogramms.</li>
	<li>Konvertieren Sie die Frequenz f-Werte in axiale Blutgeschwindigkeiten vz mit der Doppler-Formel (Eq. 3). c0 ist die Schallgeschwindigkeit im Medium und fTW die Mittelfrequenz der übertragenen Ultraschall-Wellenform (hier 5,2 MHz). <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ05v4.jpg"> Eq. 3</li>
</ol>

<ol>
	<li>Doppler, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ueber das farbige Licht der Doppelsterne und einiger anderer Gestirne des Himmels. , (2020).</li><li>Bonnefous, O., Pesqu&#233;, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+domain+formulation+of+pulse-Doppler+ultrasound+and+blood+velocity+estimation+by+cross+correlation.">Time domain formulation of pulse-Doppler ultrasound and blood velocity estimation by cross correlation.</a> Ultrasonic Imaging. 8 (2), 73-85 (2004).</li><li>Bercoff, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+compound+doppler+imaging:+Providing+full+blood+flow+characterization.">Ultrafast compound doppler imaging: Providing full blood flow characterization.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 58 (1), 134-147 (2011).</li><li>Evans, D. 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Kein Interessenkonflikt

Mehrere Varianten sind um den Hauptrahmen dieses Protokolls herum möglich.
Hardware-Bedenken Wenn der Benutzer seinen benutzerdefinierten Hostcomputer bereitstellt, müssen die Hauptplatine und das Gehäuse des Computers über einen verfügbaren PCI-Express-Steckplatz verfügen. Die CPU muss auch über genügend PCIe-Lanes verfügen, um alle Geräte zu verarbeiten.
Sondenauswahl Die Ultraschallsonde (auch Wandler genannt) wir...

Ultraschall-Bildgebung ist eines der am häufigsten verwendeten bildgebenden Verfahren in der klinischen Praxis und Forschungsaktivitäten. Die Kombination der Ultraschallwellenemission in den biologischen Geweben, gefolgt von der Aufzeichnung der rückgestreuten Echos, ermöglicht die Rekonstruktion anatomischer Bilder, des sogenannten "B-Mode". Diese Methode ist perfekt für die Bildgebung von Weichgeweben geeignet, wie z. B. biologische Gewebe, die typischerweise das Eindringen von Ultraschall über mehrere Zentimeter ermöglichen, mit einer Ausbreitungsgeschwindigkeit von ≈1540 m/s. Je nach Mittelfrequenz der Ultraschallsonde werden Bilder mit einer Auflösung von 30 bis 1 mm erhalten. Darüber hinaus ist bekannt, dass die Bewegung einer akustischen Quelle die physikalischen Eigenschaften der zugehörigen Wellen beeinflusst. Insbesondere wird die Verbindung zwischen den Frequenzverschiebungen einer Welle relativ zur Geschwindigkeit ihrer Quelle als Dopplereffekt1beschrieben, dessen einfachste Manifestation die sich verändernde Sirene eines sich bewegenden Krankenwagens ist. Ultraschall-Bildgebung hat diesen physikalischen Effekt seit langem verwendet, um die sich bewegenden roten Blutkörperchen zu beobachten2, und es schlägt eine Vielzahl von bildgebenden Modi häufig als "Doppler-Bildgebung" bezeichnet. Diese Modi ermöglichen die Beurteilung von Blutflüssen in sehr unterschiedlichen Anwendungen und Organen, wie Gehirn, Herz, Niere oder periphere Arterien.
Bemerkenswert ist, dass die meisten derzeit verfügbaren Ultraschallsysteme auf die gleiche Technologie angewiesen sind, die als konventioneller Ultraschall bezeichnet wird. Die Grundprinzipien sind folgende: Ein akustischer Strahl insonifiziert das Sichtfeld und wird entlang der Ultraschallwandleröffnung gefegt. Für jede Position des Balkens werden die Echos aufgezeichnet und in eine Zeile des endgültigen Bildes umgewandelt. Durch schrittweises Verschieben des Strahls entlang des Messumformers kann das gesamte Sichtfeld zeilenweise abgebildet werden(Abbildung 1, linkes Bedienfeld). Diese Strategie war gut an die elektrischen Zwänge und Rechenleistung angepasst, die bis zum Beginn des 21. Jahrhunderts vorherrschte. Dennoch hat es mehrere Nachteile. Unter diesen ist die endgültige Framerate durch den Strahlscanprozess auf einige hundert Bilder pro Sekunde begrenzt. In Bezug auf den Blutfluss beeinflusst diese relativ niedrige Framerate die maximal zu erkennenden Strömungsgeschwindigkeiten, die durch die Stichprobenkriterien von Shannon-Nyquist3diktiert werden. Darüber hinaus muss der konventionelle Doppler mit einem komplexen Kompromiss fertig werden. Um die Durchblutungsgeschwindigkeit in einer bestimmten Interessenregion (ROI) zu bewerten, müssen mehrere Echos, die von diesem ROI stammen, sukzessive aufgezeichnet werden. Dies bedeutet, dass der Ultraschallstrahl vorübergehend in einer festen Position gehalten wird. Je länger das Echo-Ensemble, desto besser ist die Geschwindigkeitsschätzung für diesen ROI. Um jedoch ein vollständiges Bild des Sichtfeldes zu erzeugen, muss der Strahl das Medium scannen. Daher kann man den Konflikt zwischen diesen beiden Einschränkungen spüren: halten Sie den Strahl, um die Geschwindigkeit entlang einer Linie genau zu bewerten, oder bewegen Sie den Strahl, um ein Bild zu erzeugen. Die verschiedenen herkömmlichen Doppler-Modi (z.B. Color Doppler oder Pulse Wave Doppler) spiegeln diesen Kompromiss direkt wider. In der Regel erzeugt der Farbdoppler eine Low-Fidelity-Flow-Map, die für die Lokalisierung der Gefäße4verwendet wird, und der Pulswellendoppler wird dann verwendet, um den Fluss in einem zuvor identifizierten Gefäß genau zu quantifizieren5.
Diese beiden Einschränkungen (niedrige Framerate und Lokalisierung/Quantifizierungs-Kompromiss) werden mit sehr hochformatigen neu auftretenden Techniken überwunden. Unter diesen kann der synthetische Blendenansatz6 oder die multiline Sendetechnik zitiert werden7. In dieser Studie konzentrieren wir uns auf die sogenannte Ultrafast-Ultraschall-Methode. Eingeführt vor zwei Jahrzehnten8,9,10, diese Methode beruht auch auf der Emission / Empfang von Ultraschall, aber mit einem radikal anderen Muster. Anstatt einen scanning fokussierten Strahl zu verwenden, verwendet ultraschnelle Bildgebung Ebenenwellen oder divergierende Wellen, die in der Lage sind, das Sichtfeld mit einer einzigen Emission zu insonifizieren. Nach dieser einmaligen Emission ist die zugehörige Elektronik auch in der Lage, die große Anzahl von Echos aus dem gesamten Sichtfeld zu empfangen und zu verarbeiten. Am Ende kann ein Bild aus einem einzigen Emissions-/Empfangsmuster11 rekonstruiert werden (Abbildung 1, rechtes Panel). Diese unfokussierten Emissionen können aufgrund der Ausbreitung der akustischen Energie ein niedriges Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) aufweisen. Dies kann durch das Aussenden mehrerer betitelter Ebenenwellen (oder divergierender Wellen mit unterschiedlichen Quellen) und durch Hinzufügen der resultierenden Bilder angegangen werden. Diese Methode wird "kohärente Compoundierung"12genannt. Zwei große Konsequenzen ergeben sich. Erstens hängt die Framerate nur von der Ultraschallzeit des Fluges ab und kann typische Werte von 1 bis 10 kHz erreichen. Zweitens gewährleistet dies die Datenkontinuität sowohl in räumlichen als auch in zeitlichen Dimensionen, die auch als raumzeitliche Kohärenz bezeichnet werden. Der herkömmliche Lokalisierungs-/Quantifizierungskompromiss ist somit gebrochen. Diese Kombination aus hoher Framerate und raumzeitlicher Kohärenz hat einen enormen Einfluss auf die Fähigkeit, Blutflüsse mit Ultraschall zu erkennen. Im Vergleich zu herkömmlichem Ultraschall bietet ultraschneller Ultraschall eine vollständige Charakterisierung des Blutflusses3. Praktisch hat der Benutzer Zugriff auf den Geschwindigkeitszeitverlauf in jedem Pixel des Bildes, für die gesamte Dauer der Erfassung (typischerweise ≈1 s), mit einer Zeitskala, die durch die Framerate angegeben wird (typischerweise eine Framerate von 5 kHz für eine zeitliche Auflösung von 200 s). Diese hohe Framerate macht die Methode für eine breite Palette von Anwendungen geeignet, wie z.B. schnellen Fluss in beweglichen Organen wie Herzkammern13 oder Myokard mit der koronaren Mikroperfusion14. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass seine räumlich-zeitliche Kohärenz seine Fähigkeit, langsamen Blutfluss von sich bewegenden Hintergrundgeweben zu trennen, stark verbessert, wodurch die Empfindlichkeit gegenüber mikrovaskulärem Fluss15erhöht wird. Diese Kapazität ermöglicht den Zugang zur Mikrovaskulatur des Gehirns bei Tieren16 und Menschen17.
Daher ist ultraschneller Ultraschall gut geeignet, um den Blutfluss in einer Vielzahl von Situationen abzubilden. Es ist auf weiche biologische Gewebe beschränkt und wird stark durch das Vorhandensein von harten Schnittstellen wie Knochen, oder Gashöhle wie die Lunge beeinflusst werden. Die Abstimmung der physikalischen Parameter der Ultraschallsequenz ermöglicht die Untersuchung sowohl langsamer (bis zu 1 mm/s11,16) als auch schneller Ströme (bis zu mehreren m/s). Zwischen der räumlichen Auflösung und der Tiefe der Durchdringung besteht ein Kompromiss. Typischerweise kann eine Auflösung von 50 m auf Kosten einer Penetration um 5 mm erreicht werden. Umgekehrt kann die Penetration auf 15-20 cm mit einer Auflösung von 1 mm erweitert werden. Es ist erwähnenswert, dass die meisten ultraschnellen Scanner, wie sie in diesem Artikel verwendet werden, nur 2D-Bilder liefern.
Hier schlagen wir ein einfaches Protokoll vor, um das Konzept der Ultrafast Doppler-Bildgebung mit einem programmierbaren Forschungs-Ultraschallscanner und Doppler-Phantom zu verwenden, das ein Gefäß (Arterie oder Vene) imitiert, das in biologisches Gewebe eingebettet ist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood-mimicking fluid</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>069DTF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doppler flow phantom</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>ATS523A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks, Natick, Massachusetts, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump / Doppler flow pump</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>769</td>
			<td>Include tubings and pulse dampener</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer adpter</td>
			<td>Verasonics, Kirkland, Washington, USA</td>
			<td>UTA 408-GE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast ultrasound research scanner</td>
			<td>Verasonics, Kirkland, Washington, USA</td>
			<td>Vantage 256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound probe/transducer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE 9L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

blood flow imaging with ultrafast doppler

Der gepulste Doppler-Effekt ist die Haupttechnik, die in der klinischen Echographie zur Beurteilung des Blutflusses verwendet wird. Angewandt mit herkömmlichen fokussierten Ultraschall-Doppler-Modi, hat es mehrere Grenzen. Erstens ist eine fein abgestimmte Signalfilterung erforderlich, um Blutflüsse von umgebenden beweglichen Geweben zu unterscheiden. Zweitens muss der Bediener wählen, ob er die Blutflüsse lokalisiert oder quantifiziert. In den letzten zwei Jahrzehnten hat die Ultraschall-Bildgebung einen Paradigmenwechsel mit der Entstehung von ultraschnellem Ultraschall mit unfokussierten Wellen durchgemacht. Neben einer hundertfachen Erhöhung der Framerate (bis zu 10000 Hz) bricht diese neue Technik auch den konventionellen Quantifizierungs-/Lokalisierungskompromiss und bietet eine vollständige Blutfluss-Mapping des Sichtfeldes und einen gleichzeitigen Zugriff auf Fließgeschwindigkeitenmessungen auf Ein-Pixel-Ebene (bis zu 50 m). Diese Datenkontinuität sowohl in räumlichen als auch in zeitlichen Dimensionen verbessert den Gewebe-Blut-Filterprozess stark, was zu einer Erhöhung der Empfindlichkeit gegenüber kleinen Durchblutungsgeschwindigkeiten führt (bis zu 1 mm/s). In diesem Methodenpapier wollen wir das Konzept des ultraschnellen Dopplers sowie seine Hauptparameter vorstellen. Erstens fassen wir die physikalischen Prinzipien der unfokussierten Wellenbildgebung zusammen. Anschließend stellen wir die Hauptschritte der Doppler-Signalverarbeitung vor. Insbesondere erklären wir die praktische Umsetzung der kritischen Gewebe-/Blutflusstrennalgorithmen und die Extraktion von Geschwindigkeiten aus diesen gefilterten Daten. Diese theoretische Beschreibung wird durch In-vitro-Erfahrungen ergänzt. Ein Gewebe-Phantom, das einen Kanal mit fließender blutimitierender Flüssigkeit einbettet, wird mit einem forschungsprogrammierbaren Ultraschallsystem abgebildet. Es wird ein Durchflussbild erhalten und die Strömungseigenschaften werden für mehrere Pixel im Kanal angezeigt. Schließlich wird eine Überprüfung der In-vivo-Anwendungen vorgeschlagen, die Beispiele in mehreren Organen wie Karotis, Niere, Schilddrüse, Gehirn und Herz zeigt.

Die Qualität der Anschaffung und der Nachbearbeitung wird zunächst durch Sichtprüfung beurteilt. Die Form des Kanals muss im Power-Doppler-Bild deutlich sichtbar sein, und der Gewebebereich muss dunkel erscheinen. Wenn das Power-Doppler-Signal nicht auf den Kanal beschränkt ist, kann dies bedeuten, dass entweder der Unordnungsfilterschritt schief gelaufen ist (SVD-Schwellenwert ist zu niedrig), oder die Sonde während der Erfassung eine starke Bewegung erlebt hat.
Nach der visuellen Unters...

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Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Dieses Protokoll zeigt, wie ultraschnelle Ultraschall-Doppler-Bildgebung angewendet wird, um Blutflüsse zu quantifizieren. Nach einer 1 s langen Erfassung hat der Experimentator Zugriff auf einen Film des gesamten Sichtfeldes mit axialen Geschwindigkeitswerten für jedes Pixel pro ≈0,3 ms (abhängig von der Ultraschallzeit des Fluges).

Blutfluss-Bildgebung mit ultraschnellem Doppler

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

blood-flow-imaging-with-ultrafast-doppler

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7.3K Aufrufe.  The Hospital for Sick Children, PGCRL Research Institute. Dieses Protokoll zeigt, wie ultraschnelle Ultraschall-Doppler-Bildgebung angewendet wird, um Blutflüsse zu quantifizieren. Nach einer 1 s langen Erfassung hat der Experimentator Zugriff auf einen Film des gesamten Sichtfeldes mit axialen Geschwindigkeitswerten für jedes Pixel pro ≈0,3 ms (abhängig von der Ultraschallzeit des Fluges).

Serie: Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Lokalisierung und Relative Quantifizierung der Kohlenstoff-Nanoröhrchen in Zellen mit multispektrale Imaging Durchflusszytometrie

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Forschung

Biotechnik

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Verbesserte Methode zur Präparation einer menschlichen Zelle-basierte, Kontakt Modell der Blut-Hirn-Schranke

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Sensitive Detection von Proteopathic Seeding Aktivität mit FRET Durchflusszytometrie

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

In-vitro-Modell von physiologischen und pathologischen Blutfluss mit Anwendung auf Untersuchungen der Gefäßzell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Mikrofluidik-Strömungskammern Mit Rekonstituierte Blut Hämostaseologie und Transfusions Platelet zu Modell<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Ein Mikrofluidik-Flow-Kammer-Modell für Platelet Transfusions und Hämostase Maßnahmen Platelet Deposition und Fibrinbildung in Echtzeit

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a key hemodynamic parameter related to cerebral oxygen supply. Resting state low frequency fluctuations based on oxygenation contrast have been shown to provide correlations between functionally connected regions. The presented protocol uses optical diffuse correlation spectroscopy (DCS) to assess blood flow-based resting state functional connectivity (RSFC) in the human brain. Results of CBF-based RSFC in human frontal cortex indicate that intra-regional RSFC is significantly higher in the left and right cortices compared to inter-regional RSFC in both cortices. This protocol should be of interest to researchers who employ multi-modal imaging techniques to study human brain function, especially in the pediatric population.

This protocol demonstrates how to measure resting state functional connectivity in the human prefrontal cortex using a custom-made diffuse correlation spectroscopy instrument. The report also discuss practical aspects of the experiment as well as detailed steps for analyzing the data.

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Charakterisierung von Einzelmolekül-Konformationsänderungen unter Scherfluss mit Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

Hochdimensionale Durchflusszytometrie zur Immunfunktionsanalyse von präpariertem Implantatgewebe

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Quantifizierung der Fibrillar Collagen Organisation mit Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...