Vorremmo ringraziare Shreya Shah per la sua correzione di bozze e i suoi consigli.

1. Configurazione della preparazione fantasma doppler (Figura 2A)
<ol><li>Collegare la pompa peristaltica, il serbatoio del fluido imitante del sangue, lo smorzatore di impulsi e il fantasma del flusso Doppler con i tubi di plastica.</li>
	<li>Scegli il canale con un diametro di 4 mm.</li>
	<li>Programmare la pompa per espellere 720 mL/min di liquido per 0,3 s e quindi espellere 50 mL/min per 0,7 s per imitare rispettivamente le fasi cardiache sistole e diastole</li>
	<li>Far funzionare la pompa e scuotere delicatamente i tubi per espellere potenziali bolle d'aria. NOTA: L'operatore può scegliere un diametro del canale diverso e una velocità di pompaggio diversa, ma dovrà assicurarsi che la sequenza ad ultrasuoni sia abbastanza veloce da acquisire le velocità di flusso più veloci. Eq. 3 presentato in seguito può aiutare a progettare la sequenza.</li>
</ol>2. Configurazione dello scanner ad ultrasuoni ultraveloce(Figura 2A)
<ol><li>Collegare lo scanner di ricerca ultraveloce al computer host con il collegamento PCI express.</li>
	<li>Cambiare l'adattatore del trasduttore sullo scanner ad ultrasuoni in modo che corrisponda al connettore della sonda, quindi collegare la sonda.</li>
	<li>Eseguire Matlab e attivare la licenza dello scanner ad ultrasuoni. NOTA: Questa sezione e quanto segue assumono implicitamente l'uso di un sistema Verasonics Vantage.</li>
</ol>3. Programmazione di sequenze ad ultrasuoni
<ol><li>Utilizzando gli script degli esempi, progettare una sequenza convenzionale focalizzata "B-Mode" (cioè ecografia) che verrà utilizzata per il posizionamento della sonda.<ol>
<li>Impostare la profondità di imaging su 50 mm.</li>
		<li>Impostare la profondità focale su 35 mm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzando gli script degli esempi, progetta una sequenza di ultrasuoni ultraveloce.<ol>
<li>Impostare la profondità di imaging su 50 mm.</li>
		<li>Programma 3 onde piane inclinate a [-3,0,3] grado.</li>
		<li>Impostare la frequenza di ripetizione dell'impulso (PRF) su 12 kHz.</li>
		<li>Utilizzare 4 semicicli per la forma d'onda ad ultrasuoni, con una frequenza centrale a seconda della sonda utilizzata. Qui si assume una frequenza centrale di 5,2 MHz.</li>
		<li>Impostare la durata totale su 1 s.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Posizionamento sonda e acquisizione dati
<ol><li>Applicare il gel ad ultrasuoni sull'obiettivo della sonda.</li>
	<li>Posizionare la sonda sul fantasma e avviare la sequenza di ultrasuoni B-Mode.</li>
	<li>Individua il canale di interesse. Il fluido appare più scuro del tessuto circostante. Posizionare la sonda in vista longitudinale.</li>
	<li>Mantenere manualmente la sonda nella posizione di interesse.</li>
	<li>Termina la sequenza B-Mode e avvia lo script di acquisizione della sequenza ultraveloce.</li>
</ol>5. Ricostruzione dell'immagine( Figura 2B)
<ol><li>Una volta terminata la sequenza, salvare i dati grezzi (chiamati anche dati a radiofrequenza, "RF").</li>
	<li>Avviare lo script di ricostruzione delle immagini utilizzando il software predefinito del sistema ad ultrasuoni. Al termine del processo, è necessario creare la matrice di dati QI. NOTA: Gli echi ecografico vengono registrati su ogni elemento della sonda e per ogni emissione/ricezione, quindi memorizzati nella matrice di dati RF. La ricostruzione dell'immagine ha applicato la legge di ritardo appropriata a ciascun canale e si traduce nella cosiddetta matrice "QI" (In-Phase/Quadrature). La complessa matrice QI ha tre dimensioni: due per lo spazio (profondità e larghezza dell'immagine) e una per il tempo</li>
</ol>6. Filtraggio degli ingombro(figura 2C)
NOTA: Per i passaggi da 6 a 7, vedere lo script Matlab fornito nel materiale supplementare.
<ol><li>Rimodellare la matrice IQ 3D (spazio x spazio x tempo) in una matrice Casorati 2D (spazio x ora), denominata IQr.</li>
	<li>Calcolare la decomposizione del valore singolare15 di IQr (Eq. 1). <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ01v3.jpg"> Eq. 1</li>
	<li>Calcola la matrice di somiglianza spaziale C usando i vettori spaziali singolari U come descritto da Baranger etal.</li>
	<li>Utilizzare questo cutoff N per filtrare i dati del QI come descritto in Demene etal.</li>
</ol>7. Visualizzazione del flusso e misurazioni della velocità (Figura 2C)
<ol><li>Potenza di calcolo Doppler mappa PD integrando l'inviluppo dei dati filtrati QIt lungo la dimensione temporale (Eq. 2). Le coordinate 3D z, x e t sono rispettivamente la profondità, la larghezza e la dimensione temporale, nt e è il numero di fotogrammi acquisiti. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ02v5.jpg"> Eq. 2</li>
	<li>Visualizzare la mappa PD in scala logaritmica. Per impostare l'intervallo dinamico, calcolare la PD media in una regione al di fuori del canale e utilizzare questo valore in dB come limite inferiore dell'intervallo dinamico. Un intervallo dinamico tipico è [-30, 0] dB.</li>
	<li>Definire un'area circolare di interesse (ROI) sull'immagine, contenente da 1 a 30 pixel.</li>
	<li>Media del segnale FQI sui pixel di quel ROI, per ottenere un vettore <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ03v2.jpg"> di nt punti di tempo.</li>
	<li>Calcola e visualizza lo spettrogramma Doppler di <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ04v2.jpg"> , utilizzando la grandezza quadrata della trasformata di Fourier a tempo breve (STFT).<ol>
<li>Impostare la finestra STFT su una finestra Hann da 60 campioni.</li>
		<li>Impostate la sovrapposizione STFT sul 90% della lunghezza della finestra.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sovrapporre la frequenza centrale in ogni punto del tempo dello spettrogramma.</li>
	<li>Convertire i valori di frequenza f in velocità assiali del sangue vz usando la formula doppler (Eq. 3). c0 è la velocità del suono nel mezzo e fTW la frequenza centrale della forma d'onda ad ultrasuoni trasmessa (qui 5,2 MHz). <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61838/61838equ05v4.jpg"> Eq. 3</li>
</ol>

<ol>
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Nessun conflitto di interessi

Sono possibili diverse varianti intorno al frame principale di questo protocollo.
Problemi hardware Se l'utente fornisce il proprio computer host personalizzato, la scheda madre e la custodia del computer devono avere uno slot espresso PCI disponibile. La CPU deve anche avere abbastanza corsie PCIe per gestire tutti i dispositivi.
Selezione sonda La sonda ad ultrasuoni (chiamata anche trasduttore) viene scelta in base alla ris...

L'imaging ad ultrasuoni è una delle tecniche di imaging più comunemente utilizzate nella pratica clinica e nelle attività di ricerca. La combinazione di emissione di onde ultrasoniche nei tessuti biologici seguita dalla registrazione degli echi retroscatterati consente la ricostruzione delle immagini anatomiche, la cosiddetta "B-Mode". Questo metodo è perfettamente adattato per l'imaging dei tessuti molli, come i tessuti biologici, che in genere consentono la penetrazione di ultrasuoni su diversi centimetri, con una velocità di propagazione di ≈1540 m /s. A seconda della frequenza centrale della sonda ad ultrasuoni, si ottengono immagini con una risoluzione da 30 μm a 1 mm. Inoltre, è ben noto che il moto di una sorgente acustica, influenza le caratteristiche fisiche delle onde associate. In particolare, il legame tra gli spostamenti di frequenza di un'onda rispetto alla velocità della sua sorgente è descritto come l'effetto Doppler1, la cui manifestazione più semplice è il passo della sirena che cambia di un'ambulanza in movimento. L'imaging ad ultrasuoni ha utilizzato a lungo questo effetto fisico per osservare i globulirossi in movimento 2e propone una varietà di modalità di imaging comunemente etichettate come "Imaging Doppler". Queste modalità consentono la valutazione dei flussi sanguigni in applicazioni e organi molto diversi, come cervello, cuore, reni o arterie periferiche.
Sorprendentemente, la maggior parte dei sistemi ad ultrasuoni attualmente disponibili si basa sulla stessa tecnologia, definita ultrasuoni convenzionali. I principi alla base sono i seguenti: un fascio acustico insonizza il campo visivo e viene spazzato lungo l'apertura del trasduttore ad ultrasuoni. Per ogni posizione del fascio, gli echi vengono registrati e convertiti in una linea dell'immagine finale. Spostando progressivamente il fascio lungo il trasduttore, l'intero campo visivo può essere immaginato riga per riga (Figura 1, pannello sinistro). Questa strategia era ben adattata ai vincoli elettrici e alla potenza di calcolo prevalente fino all'inizio del 21 ° secolo. Tuttavia, ha diversi inconvenienti. Tra questi, la frequenza fotogrammi finale è limitata a poche centinaia di immagini al secondo dal processo di scansione del fascio. In termini di flusso sanguigno, questa frequenza fotogrammi relativamente bassa influisce sulle velocità massime del flusso che possono essere rilevate, che è dettata dai criteri di campionamento di Shannon-Nyquist3. Inoltre, doppler convenzionale deve affrontare un compromesso complesso. Per valutare la velocità del flusso sanguigno in una particolare regione di interesse (ROI), è necessario registrare successivamente diversi echi provenienti da tale ROI. Ciò implica che il fascio ad ultrasuoni viene temporaneamente mantenuto in posizione fissa. Più lungo è l'insieme dell'eco, migliore sarà la stima della velocità per quel ROI. Tuttavia, per produrre un'immagine completa del campo visivo, il fascio deve scansionare il mezzo. Pertanto, si può percepire il conflitto tra questi due vincoli: tenere il fascio per valutare con precisione la velocità lungo una linea, o spostare il fascio per produrre un'immagine. Le diverse modalità Doppler convenzionali (ad esempio, Color Doppler o Pulse Wave Doppler) riflettono direttamente questo compromesso. In genere, Color Doppler produce una mappa di flusso a bassa fedeltà utilizzata per localizzare ivasi 4e Pulse Wave Doppler viene quindi utilizzato per quantificare con precisione il flusso in una nave5 precedentemente identificata.
Queste due limitazioni (basso framerate e compromesso di localizzazione/quantificazione) sono superate con tecniche emergenti ad altissima frequenza. Tra questi, l'approccio diapertura sintetica 6 o la tecnica di trasmissione multilinea possono esserecitati 7. In questo studio, ci concentriamo sul cosiddetto metodo ad ultrasuoni Ultrafast. Introdotto due decenni fa8,9,10, questo metodo si basa anche sull'emissione / ricezione degli ultrasuoni, ma con un modello radicalmente diverso. Infatti, invece di utilizzare un fascio focalizzato a scansione, l'imaging ultraveloce utilizza onde piane o onde divergenti, che sono in grado di insonificare il campo visivo con una singola emissione. A seguito di questa singola emissione, l'elettronica associata è anche in grado di ricevere ed elaborare l'enorme numero di echi provenienti da tutto il campo visivo. Alla fine, un'immagine può essere ricostruita da un singolo modello di emissione/ricezione11 (Figura 1,pannello destro). Queste emissioni non focalizzate possono avere un basso rapporto segnale/rumore (SNR) a causa della diffusione dell'energia acustica. Questo può essere affrontato emettendo diverse onde piane intitolate (o onde divergenti con fonti diverse) e aggiungendo le immagini risultanti. Questo metodo è denominato "compounding coerente"12. Ne derivano due conseguenze principali. In primo luogo, la frequenza dei fotogrammi dipende solo dal tempo di volo degli ultrasuoni e può raggiungere valori tipici da 1 a 10 kHz. In secondo luogo, ciò garantisce la continuità dei dati sia in dimensione spaziale che temporale, definita anche coerenza spaziotemporale. Il compromesso convenzionale di localizzazione/quantificazione viene quindi interrotto. Questa combinazione di un'elevata frequenza di fotogrammi e coerenza spaziotemporale ha un enorme impatto sulla capacità di rilevare i flussi sanguigni con ultrasuoni. Rispetto agli ultrasuoni convenzionali, gli ultrasuoni ultraveloce forniscono una caratterizzazione completa del flussosanguigno 3. In pratica, l'utente ha accesso al corso del tempo di velocità in ogni pixel dell'immagine, per l'intera durata dell'acquisizione (tipicamente ≈1 s), con una scala cronologica data dalla frequenza dei fotogrammi (tipicamente, una frequenza fotogrammi di 5 kHz per una risoluzione temporale di 200 μs). Questo alto framerate rende il metodo adatto per una vasta gamma di applicazioni come il flusso rapido in organi in movimentocome camere cardiache 13 o miocardio con la micro-perfusione coronarica14. Inoltre, è stato dimostrato che la sua coerenza spaziotemporale migliora fortemente la sua capacità di separare il flusso sanguigno lento dai tessuti in movimento di fondo, aumentando così la sensibilità al flussomicro-vascolare 15. Questa capacità dà accesso alla microvascolarizzazione del cervello sia negli animali16 che nell'uomo17.
Pertanto, gli ultrasuoni ultraveloci sono adatti per il flusso sanguigno dell'immagine in una varietà di situazioni. È limitato ai tessuti biologici molli e sarà fortemente influenzato dalla presenza di interfacce dure come ossa o cavità gassoso come il polmone. La messa a punto dei parametri fisici della sequenza ecografica consente lo studio sia di flussi lenti (fino a 1 mm/s11,16) che veloci (fino a diversi m/s). Esiste un compromesso tra la risoluzione spaziale e la profondità di penetrazione. Tipicamente, una risoluzione di 50 μm può essere raggiunta al costo di una penetrazione di circa 5 mm. Al contrario, la penetrazione può essere estesa a 15-20 cm al costo di una risoluzione di 1 mm. Vale la pena notare che la maggior parte degli scanner ultraveloci come quello utilizzato in questo articolo forniscono solo immagini 2D.
Qui, proponiamo un semplice protocollo per introdurre il concetto di imaging Doppler ultraveloce, utilizzando uno scanner ad ultrasuoni di ricerca programmabile e un fantasma Doppler che imita un vaso (arteria o vena) incorporato nel tessuto biologico.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Blood-mimicking fluid</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>069DTF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doppler flow phantom</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>ATS523A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>MathWorks, Natick, Massachusetts, United States</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump / Doppler flow pump</td>
			<td>CIRS Inc, Norfolk, Virginia, USA</td>
			<td>769</td>
			<td>Include tubings and pulse dampener</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transducer adpter</td>
			<td>Verasonics, Kirkland, Washington, USA</td>
			<td>UTA 408-GE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafast ultrasound research scanner</td>
			<td>Verasonics, Kirkland, Washington, USA</td>
			<td>Vantage 256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasound probe/transducer</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE 9L-D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

blood flow imaging with ultrafast doppler

L'effetto pulsato-Doppler è la tecnica principale utilizzata nell'ecografia clinica per valutare il flusso sanguigno. Applicato con le modalità Doppler ad ultrasuoni focalizzate convenzionali, ha diversi limiti. In primo luogo, è necessaria un'operazione di filtraggio del segnale finemente ottimizzata per distinguere i flussi sanguigni dai tessuti in movimento circostanti. In secondo luogo, l'operatore deve scegliere tra localizzare i flussi sanguigni o quantificarli. Negli ultimi due decenni, l'imaging ad ultrasuoni ha subito un cambiamento di paradigma con l'emergere di ultrasuoni ultraveloce utilizzando onde sfocate. Oltre a un aumento di cento volte della frequenza dei fotogrammi (fino a 10000 Hz), questa nuova tecnica rompe anche il compromesso convenzionale di quantificazione /localizzazione, offrendo una mappatura completa del flusso sanguigno del campo visivo e un accesso simultaneo alle misurazioni delle velocità fini a livello di un singolo pixel (fino a 50 μm). Questa continuità dei dati sia nelle dimensioni spaziali che temporali migliora fortemente il processo di filtraggio tessuto/sangue, il che si traduce in un aumento della sensibilità alle piccole velocità del flusso sanguigno (fino a 1 mm/s). In questo documento di metodo, miriamo a introdurre il concetto di Doppler ultraveloce e i suoi parametri principali. In primo luogo, riassumiamo i principi fisici dell'imaging delle onde non focalizzato. Quindi, presentiamo i passaggi principali di elaborazione del segnale Doppler. In particolare, spieghiamo l'implementazione pratica degli algoritmi critici di separazione tessuto/flusso sanguigno e sull'estrazione delle velocità da questi dati filtrati. Questa descrizione teorica è integrata da esperienze in vitro. Un fantasma tissutale che incorpora un canale con fluido che imita il sangue scorre è immaginato con un sistema di ultrasuoni programmabile di ricerca. Si ottiene un'immagine del flusso sanguigno e le caratteristiche del flusso vengono visualizzate per diversi pixel nel canale. Infine, viene proposta una revisione delle applicazioni in vivo, mostrando esempi in diversi organi come carotidi, reni, tiroide, cervello e cuore.

La qualità dell'acquisizione e della post-elaborazione viene prima valutata mediante ispezione visiva. La forma del canale deve essere chiaramente visibile nell'immagine doppler di potenza e l'area del tessuto deve apparire scura. Se il segnale Doppler di potenza non è limitato al canale, può significare che il passo del filtro del disordine è andato storto (la soglia SVD è troppo bassa), o la sonda ha sperimentato un forte movimento durante l'acquisizione.
Dopo l'ispezione visiva, lo stu...

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Blood Flow Imaging with Ultrafast Doppler

Questo protocollo mostra come applicare l'imaging Doppler ad ultrasuoni ultraveloce per quantificare i flussi sanguigni. Dopo un'acquisizione lunga 1 s, lo sperimentatore ha accesso a un filmato dell'intero campo visivo con valori di velocità assiale per ogni pixel ogni ≈0,3 ms (a seconda del tempo di volo ad ultrasuoni).

Imaging del flusso sanguigno con Doppler ultraveloce

The pulsed-Doppler effect is the main technique used in clinical echography to assess blood flow. Applied with conventional focused ultrasound Doppler ...

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Research

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JoVE Core

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Anatomy and Physiology

Bioengineering

Unit 1

Sampling

Blood Vessels and Circulation

SCIENTISTS IN ACTION

7.3K Views.  The Hospital for Sick Children, PGCRL Research Institute. Questo protocollo mostra come applicare l'imaging Doppler ad ultrasuoni ultraveloce per quantificare i flussi sanguigni. Dopo un'acquisizione lunga 1 s, lo sperimentatore ha accesso a un filmato dell'intero campo visivo con valori di velocità assiale per ogni pixel ogni ≈0,3 ms (a seconda del tempo di volo ad ultrasuoni).

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Localization and Relative Quantification of Carbon Nanotubes in Cells with Multispectral Imaging Flow Cytometry

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich cell structures and de facto there is still no quantitative method to assess their distribution at cell and tissue levels. What we propose here is an innovative method allowing the detection and quantification of CNTs in cells using a multispectral imaging flow cytometer (ImageStream, Amnis). This newly developed device integrates both a high-throughput of cells and high resolution imaging, providing thus images for each cell directly in flow and therefore statistically relevant image analysis. Each cell image is acquired on bright-field (BF), dark-field (DF), and fluorescent channels, giving access respectively to the level and the distribution of light absorption, light scattered and fluorescence for each cell. The analysis consists then in a pixel-by-pixel comparison of each image, of the 7,000-10,000 cells acquired for each condition of the experiment. Localization and quantification of CNTs is made possible thanks to some particular intrinsic properties of CNTs: strong light absorbance and scattering; indeed CNTs appear as strongly absorbed dark spots on BF and bright spots on DF with a precise colocalization.
This methodology could have a considerable impact on studies about interactions between nanomaterials and cells given that this protocol is applicable for a large range of nanomaterials, insofar as they are capable of absorbing (and/or scattering) strongly enough the light.

In this study, the main purpose was to monitor the cellular uptake and eventual exocytosis of carbon nanotubes (CNTs). From this perspective, we proposed here a unique method using multispectral imaging flow cytometry allowing a quantification and localization of CNTs in a statistically relevant number of cells.

Localizzazione e quantificazione relativa dei nanotubi di carbonio in cellule con immagini multispettrali Citometria a Flusso

Carbon-based nanomaterials, like carbon nanotubes (CNTs), belong to this type of nanoparticles which are very difficult to discriminate from carbon-rich ...

Ricerca

Bioingegneria

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Sensitive Detection of Proteopathic Seeding Activity with FRET Flow Cytometry

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and progression of pathology in several neurodegenerative diseases, including Alzheimer's disease and the related tauopathies. The potentially critical role of tau seeds in disease progression strongly supports the need for a sensitive assay that readily detects seeding activity in biological samples. 
By combining the specificity of fluorescence resonance energy transfer (FRET), the sensitivity of flow cytometry, and the stability of a monoclonal cell line, an ultra-sensitive seeding assay has been engineered and is compatible with seed detection from recombinant or biological samples, including human and mouse brain homogenates. The assay employs monoclonal HEK 293T cells that stably express the aggregation-prone repeat domain (RD) of tau harboring the disease-associated P301S mutation fused to either CFP or YFP, which produce a FRET signal upon protein aggregation. The uptake of proteopathic tau seeds (but not other proteins) into the biosensor cells stimulates aggregation of RD-CFP and RD-YFP, and flow cytometry sensitively and quantitatively monitors this aggregation-induced FRET. The assay detects femtomolar concentrations (monomer equivalent) of recombinant tau seeds, has a dynamic range spanning three orders of magnitude, and is compatible with brain homogenates from tauopathy transgenic mice and human tauopathy subjects. With slight modifications, the assay can also detect seeding activity of other proteopathic seeds, such as &#945;-synuclein, and is also compatible with primary neuronal cultures. The ease, sensitivity, and broad applicability of FRET flow cytometry makes it useful to study a wide range of protein aggregation disorders.

Cell-to-cell transfer of protein aggregates, or proteopathic seeds, may underlie the progression of pathology in neurodegenerative diseases. Here, a novel FRET flow cytometry assay is described that enables specific and sensitive detection of seeding activity from recombinant or biological samples.

Rilevazione sensibile di Proteopathic Semina attività con FRET Citometria a flusso

Increasing evidence supports transcellular propagation of toxic protein aggregates, or proteopathic seeds, as a mechanism for the initiation and ...

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards vascular disease pathologies. Unhealthy arteries often present with wall stiffening, scarring, or partial stenosis which may all affect fluid flow rates, and the magnitude of pulsatile flow, or pulsatility index. Replication of various flow conditions is the result of tuning a flow pressure damping chamber downstream of a blood pump. Introduction of air within a closed flow system allows for a compressible medium to absorb pulsatile pressure from the pump, and therefore vary the pulsatility index. The method described herein is simply reproduced, with highly controllable input, and easily measurable results. Some limitations are recreation of the complex physiological pulse waveform, which is only approximated by the system. Endothelial cells, smooth muscle cells, and fibroblasts are affected by the blood flow through the artery. The dynamic component of blood flow is determined by the cardiac output and arterial wall compliance. Vascular cell mechano-transduction of flow dynamics may trigger cytokine release and cross-talk between cell types within the artery. Co-culture of vascular cells is a more accurate picture reflecting cell-cell interaction on the blood vessel wall and vascular response to mechanical signaling. Contribution of flow dynamics, including the cell response to the dynamic and mean (or steady) components of flow, is therefore an important metric in determining disease pathology and treatment efficacy. Through introducing an in vitro co-culture model and pressure damping downstream of blood pump which produces simulated cardiac output, various arterial disease pathologies may be investigated.

In Vitro Model of Physiological and Pathological Blood Flow with Application to Investigations of Vascular Cell Remodeling

This protocol replicates physiological or pathological blood flow in vitro to aid in determining cell response in disease pathologies. By introducing a pressure damping chamber downstream of a blood pump, blood flow across the vasculature can be recapitulated and imposed on a monolayer of vascular endothelium or a mimetic co-culture.

Modello in vitro di fisiologiche e patologiche flusso sanguigno con applicazione di indagini di rimodellamento vascolare cellulare

Vascular disease is a common cause of death within the United States. Herein, we present a method to examine the contribution of flow dynamics towards ...

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

Microfluidic Flusso Camere con sangue ricostituito al modello Emostasi e piastrine Transfusion<em&gt; In Vitro</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

Un Microfluidic flusso Camera Modello per la trasfusione di piastrine e Emostasi Misure Deposizione delle piastrine e la formazione di fibrina in tempo reale

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Cerebral Blood Flow-Based Resting State Functional Connectivity of the Human Brain using Optical Diffuse Correlation Spectroscopy

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a key hemodynamic parameter related to cerebral oxygen supply. Resting state low frequency fluctuations based on oxygenation contrast have been shown to provide correlations between functionally connected regions. The presented protocol uses optical diffuse correlation spectroscopy (DCS) to assess blood flow-based resting state functional connectivity (RSFC) in the human brain. Results of CBF-based RSFC in human frontal cortex indicate that intra-regional RSFC is significantly higher in the left and right cortices compared to inter-regional RSFC in both cortices. This protocol should be of interest to researchers who employ multi-modal imaging techniques to study human brain function, especially in the pediatric population.

This protocol demonstrates how to measure resting state functional connectivity in the human prefrontal cortex using a custom-made diffuse correlation spectroscopy instrument. The report also discuss practical aspects of the experiment as well as detailed steps for analyzing the data.

Connettività funzionale dello stato di riposo basato sul flusso sanguigno cerebrale del cervello umano utilizzando la spettroscopia ottica di correlazione diffusa

To obtain a comprehensive understanding of the human brain, utilization of cerebral blood flow (CBF) as a source of contrast is desired because it is a ...

Characterizing Single-Molecule Conformational Changes Under Shear Flow with Fluorescence Microscopy

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as atomic force microscopy have limited temporal resolution, while F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) only allow conformations to be inferred. Fluorescence microscopy, on the other hand, allows real-time in situ visualization of single molecules in various flow conditions. Our protocol describes the steps to capture conformational changes of single biomolecules under different shear flow environments using fluorescence microscopy. The shear flow is created inside microfluidic channels and controlled by a syringe pump. As demonstrations of the method, von Willebrand factor (VWF) and lambda DNA are labeled with biotin and fluorophore and then immobilized on the channel surface. Their conformations are continuously monitored under variable shear flow using total internal reflection (TIRF) and confocal fluorescence microscopy. The reversible unraveling dynamics of VWF are useful for understanding how its function is regulated in human blood, while the conformation of lambda DNA offers insights into the biophysics of macromolecules. The protocol can also be widely applied to study the behavior of polymers, especially biopolymers, in varying flow conditions and to investigate the rheology of complex fluids.

We present a protocol for immobilizing single macromolecules in microfluidic devices and quantifying changes in their conformations under shear flow. This protocol is useful for characterizing the biomechanical and functional properties of biomolecules such as proteins and DNA in a flow environment.

Caratterizzazione dei cambiamenti conformazionali a singola molecola sotto il flusso di taglio con microscopia contro la fluorescenza

Single-molecule behavior under mechanical perturbation has been characterized widely to understand many biological processes. However, methods such as ...

High-Dimensionality Flow Cytometry for Immune Function Analysis of Dissected Implant Tissues

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. Considering an implant as a foreign body, a hostile and dysregulated immune response may result in the rejection of the implant, while a regulated response and regaining of homeostasis can lead to its acceptance. Analyzing the microenvironments of implants dissected out under in vivo or ex vivo&#160;settings can help in understanding the pattern of immune response, which can ultimately help in developing new generations of biomaterials. Flow cytometry is a well-known technique for characterizing immune cells and their subsets based on their cell surface markers. This review describes a protocol based on manual dicing, enzymatic digestion, and filtration through a cell strainer for the isolation of uniform cell suspensions from dissected implant tissue. Further, a multicolor flow cytometry staining protocol has been explained, along with steps for initial cytometer settings to characterize and quantify these isolated cells by flow cytometry.

Isolation of cells from dissected implants and their characterization by flow cytometry can significantly contribute to understanding the pattern of immune response against implants. This paper describes a precise method for the isolation of cells from dissected implants and their staining for flow cytometric analysis.

Citometria a flusso ad alta dimensionalità per l'analisi della funzione immunitaria di tessuti implantari sezionati

The success of implanting laboratory-grown tissue or a medical device in an individual is subject to the immune response of the recipient host. ...

Quantifying Fibrillar Collagen Organization with Curvelet Transform-Based Tools

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression of a wide range of diseases including breast, ovarian, kidney, and pancreatic cancers. Freely available fiber quantification software tools are mainly focused on the calculation of fiber alignment or orientation, and they are subject to limitations such as the requirement of manual steps, inaccuracy in detection of the fiber edge in noisy background, or lack of localized feature characterization. The collagen fiber quantitation tool described in this protocol is characterized by using an optimal multiscale image representation enabled by curvelet transform (CT). This algorithmic approach allows for the removal of noise from fibrillar collagen images and the enhancement of fiber edges to provide location and orientation information directly from a fiber, rather than using the indirect pixel-wise or window-wise information obtained from other tools. This CT-based framework contains two separate, but linked, packages named &#8220;CT-FIRE&#8221; and &#8220;CurveAlign&#8221; that can quantify fiber organization on a global, region of interest (ROI), or individual fiber basis. This quantification framework has been developed for more than ten years and has now evolved into a comprehensive and user-driven collagen quantification platform. Using this platform, one can measure up to about thirty fiber features including individual fiber properties such as length, angle, width, and straightness, as well as bulk measurements such as density and alignment. Additionally, the user can measure fiber angle relative to manually or automatically segmented boundaries. This platform also provides several additional modules including ones for ROI analysis, automatic boundary creation, and post-processing. Using this platform does not require prior experience of programming or image processing, and it can handle large datasets including hundreds or thousands of images, enabling efficient quantification of collagen fiber organization for biological or biomedical applications.

Here, we present a protocol to use a curvelet transform-based, open-source MATLAB software tool for quantifying fibrillar collagen organization in the extracellular matrix of both normal and diseased tissues. This tool can be applied to images with collagen fibers or other types of line-like structures.

Quantificazione dell'organizzazione del collagene fibrilla con strumenti a base di trasformata curvelet

Fibrillar collagens are prominent extracellular matrix (ECM) components, and their topology changes have been shown to be associated with the progression ...