Este trabajo fue apoyado en su totalidad o en parte por los Institutos Nacionales de Salud (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 y U54 AI150472). Agradecemos al Dr. Raymond F. Schinazi y Sadie Amichai por proporcionar células infectadas con el virus de la influenza A.

1. Células semilla (Suspensión vs. Células Adherentes) en cubreobjetos o portaobjetos de cámara (el protocolo presentado utiliza cubreobjetos).
<ol><li>Siembra de células de suspensión<ol><li>Prepare cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina (PDL) (facilita la adherencia de las células de suspensión al cubreobjetos) incubando primero los cubobjetos en etanol (EtOH) durante 5 minutos (esteriliza los cubreobjetos y elimina cualquier residuo). Luego lavar 2 veces en solución salina tamponada con fosfato (PBS) antes de incubar los cubobjetos en PDL (20 μg/ml) durante 30 minutos (min) a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Retire PDL y lave 2x en PBS. Células granulares (previamente infectadas/tratadas en función de las condiciones de imagen deseadas) y resuspender 106células en 50 μL de PBS. Detectar 50 μL de células en vidrio (recubierto de PDL) e incubar a RT durante 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Siembra de células adherentes<ol><li>Cultive células en un cubreobjetos estéril colocado en un plato de 6 pocillos e infecte las células con partículas virales o trate con un compuesto de interés. Permitir que las células alcancen una confluencia del 50-70% antes de la preparación de la muestra para los experimentos de imágenes.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fijación celular: Para preservar la morfología celular para estudios de imágenes de fluorescencia
NOTA: Mantenga el 4% de PFA y PBS en RT durante al menos 30 minutos antes de la fijación celular.
<ol><li>Aspire los medios celulares, lave las células en cubreobjetos 3x en PBS y fije las células en paraformaldehído al 4% (PFA) durante 30 minutos. Aspirar PFA y lavar las células en PBS 2x. NOTA: Las células ahora pueden ser deshidratadas y almacenadas, si el experimentador desea reanudar el experimento en otra fecha. Las células fijas se pueden deshidratar en EtOH antes del almacenamiento.<ol><li>Eliminar el PBS después del lavado después de la fijación celular y reemplazar con 500 μL de EtOH al 50% (v/v en agua). Incubar a RT durante 5 min.</li>
		<li>Retire el 50% de EtOH y reemplácelo con 500 μL de EtOH al 70%. Incubar a RT durante 5 min.</li>
		<li>Eliminar el 70% de EtOH y reemplazarlo con 500 μL de 100% de EtOH. Incubar a RT durante 5 min.</li>
		<li>Retire 100% EtOH y reemplácelo con 100% EtOH fresco. NOTA: Las células deshidratadas se pueden almacenar a -20 °C durante 6 meses. Selle las placas con cinta o parafilm antes del almacenamiento para evitar la evaporación de EtOH.</li>
		<li>Rehidratar las células para pasar al etiquetado de fluorescencia multiplexada de células / virus.</li>
		<li>Retire el 100% de EtOH y reemplácelo con 500 μL de EtOH al 70%. Incubar en RT durante 2 min. NOTA: No deje que las células se sequen en ningún momento. Siempre use suficiente solución para sumergir todas las células.</li>
		<li>Eliminar el 70% de EtOH y reemplazarlo con 500 μL de 50% de EtOH. Incubar en RT durante 2 min.</li>
		<li>Elimine el 50% de EtOH y reemplácelo con 1x PBS. NOTA: Prepare la dilución de proteasa, las sondas de hibridación y el tampón de lavado antes del tratamiento con proteasa (Paso 4) y la aplicación de la sonda objetivo (Paso 5). Las instrucciones específicas sobre la preparación del reactivo se presentan al comienzo de cada paso respectivo.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reactivos</td>
			<td>Otras notas</td>
		</tr><tr><td>Solución de proteasa</td>
			<td>Prepárese en 1X PBS</td>
		</tr><tr><td>Sonda(s) de oligonucletodie diana</td>
			<td>Diluir en tampón de hibridación</td>
		</tr><tr><td>Tampón de lavado</td>
			<td>Lavados siguiendo los pasos de hibridación objetivo</td>
		</tr><tr><td>Tampón de hibridación</td>
			<td>Receta presentada en la Tabla 3</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Reactivos clave en el protocolo MICDDRP.
3. Permebilización celular: Aumenta el acceso a la célula y a los orgánulos celulares para la entrada de moléculas grandes (anticuerpos, sondas de hibridación de ácidos nucleicos)
<ol><li>Retire 1x PBS después de la fijación celular o rehidratación y reemplácelo con 500 μL de 0.1% (v/v) Tween-20 en 1x PBS. Incubar en RT durante 10 min. Reemplace uno por uno. Lavar una vez con 500 μL de 1x PBS y añadir 1x PBS fresco.</li>
</ol>4. Inmovilización de cubreobjetos en portaobjetos de vidrio y tratamiento con proteasa para eliminar las proteínas de unión al ácido nucleico del ácido nucleico viral / celular fijo para mejorar la eficiencia de la hibridación
NOTA: Prepare la solución diluida de proteasa III (ver detalles del reactivo en la Tabla de materiales) durante la permeabilización celular. Deje que la proteasa alcance la RT durante 10 minutos antes de la permeabilización.
<ol><li>Coloque una pequeña gota de esmalte de uñas en un portaobjetos de vidrio esterilizado. Seque la espalda (lado sin capa celular) y coloque el borde del cubreobjetos sobre la gota de esmalte de uñas, con el lado con las células adheridas hacia arriba. Agregue unas gotas de PBS en el cubreobjetos inmovilizado para evitar que se seque.<ol><li>Dibuje un círculo (a unos 3 mm de distancia del cubreobjetos) alrededor del perímetro del cubreobjetos ahora adherido a la diapositiva con un bolígrafo de barrera hidrófobo (bolígrafo repelente al agua que mantiene los reactivos localizados en las células).</li>
	</ol></li>
	<li>Proteasa III diluida en 1x PBS (100 μL/cubreobjetos). NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la concentración de proteasa dependiendo de las diferencias en los tipos de células, sondas o ácidos nucleicos diana a través de la optimización empírica (Ver Discusión). Para un etiquetado de ARN/ADN más eficiente en diferentes sistemas virales, tuvimos éxito con las siguientes diluciones presentadas en la Tabla 2 a continuación con diluciones que van desde (1 a 2 )-(1 a 15) (proteasa a 1x PBS).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Objetivos de sondeo</td>
			<td>Dilución de proteasa en PBS 1X (proteasa III a 1X PBS)</td>
		</tr><tr><td>ADN/ARN del VIH-1</td>
			<td>1 a 5</td>
		</tr><tr><td>HTLV-1 ADN/ARN</td>
			<td>1 a 5</td>
		</tr><tr><td>PGRNA del VHB y ARN total del VHB</td>
			<td>1 a 15</td>
		</tr><tr><td>ARN IAV</td>
			<td>1 a 15</td>
		</tr><tr><td>ARN ZIKV</td>
			<td>1 a 2</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 2: Diluciones de proteasa III en PBS para hibridación de ácidos nucleicos virales.
<ol start="3"><li>Decantar el 1x PBS en el cubreobjetos después de la inmovilización y aplicar la proteasa III diluida.</li>
	<li>Incubar en un horno humidificado a 40 °C durante 15 min.</li>
	<li>Decantar la solución de proteasa y sumergir los portaobjetos en 1x PBS. Agitar con un plato mecedor durante 2 minutos en RT. Repita el lavado con el nuevo PBS 1x.<ol><li>Solo para la detección de ADN, lavar las muestras tres veces con agua libre de nucleasas durante 2 minutos cada una, seguido de la incubación con 5 mg/ml de RNasa A diluida en PBS durante 30 min a 37 °C.</li>
		<li>Decantar la solución de RNasa A y lavar 3 veces durante 2 minutos con agua ultrapura. Continúe con ISH de las sondas objetivo. NOTA: El tampón de hibridación mejora la detección de vDNA sin afectar la eficiencia de tinción de vRNA para los resultados presentados (Resultados representativos). Sondas diluidas del canal de ADN 1 (C1) 1:1 con sonda de hibridación. Sondas de ARN C2 y C3 diluidas en tampón de hibridación. Las sondas C2 y C3 utilizadas en nuestros estudios de imagen están en soluciones 50X (1:50; sonda de destino a tampón de hibridación).</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare el tampón de hibridación en agua libre de nucleasas siguiendo el procedimiento paso a paso a continuación:<ol><li>En un tubo de 15 ml, añadir 700 μL de agua libre de nucleasa, 300 μL de sulfato de dextrano al 50% (peso/volumen (p/v)], 300 μL de NaCl 5M, 125 μL de citrato de sodio de 200 mM (pH 6,2) y 375 mg (polvo) de carbonato de etileno.</li>
		<li>Mezcle bien usando un vórtice para disolver el carbonato de etileno (asegúrese de que todo el polvo esté disuelto y la solución clara).</li>
		<li>Añadir 25 μL de Tween-20 al 10% (volumen/volumen (v/v)) y suficiente agua libre de nucleasas para completar 2,5 ml (solución 2x). NOTA: La receta para el tampón de hibridación presentado se puede encontrar en la Tabla 3 a continuación. La solución es estable durante una semana. Asegúrese de mezclar suficiente detergente Tween-20, teniendo cuidado de evitar el burbujeo de la solución.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reactivo</td>
			<td>Concentración de existencias</td>
			<td>Notas adicionales</td>
		</tr><tr><td>Agua libre de nucleasas</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Sulfato de dextrano</td>
			<td>50% (p/v)</td>
			<td>Muy viscoso</td>
		</tr><tr><td>Cloruro de sodio</td>
			<td>5 M</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Citrato de sodio (pH 6.2)</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>Conservar a 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Carbonato de etileno</td>
			<td>NA</td>
			<td>Polvo</td>
		</tr><tr><td>Preadolescente-20</td>
			<td>10% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabla 3: Lista de reactivos tampón de hibridación.
5. Incubación con sondas de hibridación diana de ADN/ARN: Las sondas de oligonucleótidos diana se unen a la(s) región(es) de interés, creando un andamio molecular para que se unan preamplificadores, amplificadores y sondas fluorescentes.
NOTA: Calentar las sondas de ADN/ARN a 40 °C durante 10 min (durante la permeabilización celular) y enfriar a RT durante al menos 10 min, si no se incluye tratamiento con RNasa. Si se necesita tratamiento con RNasa o tratamiento adicional con la muestra antes de la hibridación de la sonda objetivo, caliente las sondas en consecuencia. Girar las sondas C2 y C3 después del calentamiento y diluir en tampón de hibridación. Después de la dilución, las sondas C2 y C3 se pueden calentar brevemente. Calentar el tampón de lavado 50x (ver Tabla de materiales para más detalles) a 40 °C durante 10-20 min y diluir hasta 1x en agua de grado de biología molecular.
<ol><li>Incubar 200 μL del tampón de hibridación a 67 °C durante 10 min antes de añadir la(s) sonda(s) de hibridación. Sonda diluida en tampón de hibridación (receta indicada en la Tabla 2). Añadir 50 μL/cubreobjetos.</li>
	<li>Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 2 horas (h). Decantar sondas y sumergir diapositivas en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato durante 2 minutos en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x.</li>
</ol>6. Hibridación 1-FL del amplificador (amp): Adición de un preamplificador que es complementario a la secuencia de cola de las sondas de ADN/ARN objetivo (Paso 5)
NOTA: Los amplificadores deben estar en RT antes de su uso. Saque cada amplificador individual de la nevera 30 minutos antes de usarlo y déjelo en el banco en RT.
<ol><li>Retire las guías del 1x tampón de lavado y toque / absorba para eliminar el exceso de líquido.</li>
	<li>Agregue 1 gota de Amp 1-FL en el cubreobjetos. Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 30 min.</li>
	<li>Decantar Amp 1-FL y sumergir en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato 2 min en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x.</li>
</ol>7. Hibridación Amp 2-FL: Incubación con amplificador de señal con secuencia de reconocimiento afín a preamplificadores (Amp 1-FL)
<ol><li>Retire las guías del 1x tampón de lavado y toque / absorba para eliminar el exceso de líquido.</li>
	<li>Agregue 1 gota de Amp 2-FL en el cubreobjetos. Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 15 min.</li>
	<li>Decantar Amp 2-FL y sumergir en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato 2 min en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x.</li>
</ol>8. Hibridación Amp 3-FL: Incubación con segundo amplificador de señal
<ol><li>Retire las guías del 1x tampón de lavado y toque / absorba para eliminar el exceso de líquido.</li>
	<li>Añade 1 gota de Amp 3-FL en el cubreobjetos. Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 30 min.</li>
	<li>Decantar Amp 3-FL y sumergir en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato 2 min en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x.</li>
</ol>9. Hibridación Amp 4-FL: etiqueta fluorescente y paso final de hibridación
NOTA: En primer lugar, consulte la Tabla 4 para elegir el Amp 4 (A, B o C)- FL adecuado en función de los canales de las sondas objetivo. Evalúe qué Amp 4-FL se necesita para etiquetar el ADN/ARN de interés. En la siguiente tabla se proporciona un ejemplo:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Un</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td>Canal de ADN 1 (C1)</td>
			<td>488</td>
			<td>550</td>
			<td>550</td>
		</tr><tr><td>Canal 2 (C2) de ADN/ARN</td>
			<td>550</td>
			<td>488</td>
			<td>647</td>
		</tr><tr><td>Canal de ARN 3 (C3)</td>
			<td>647</td>
			<td>647</td>
			<td>488</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 4: Selección de la sonda fluorescente Amp 4 (A, B o C)-FL para ISH multiplexada.
NOTA: Para FISH multiplexados (múltiples objetivos), elegir el Amp 4 (A, B o C)- FL correcto es fundamental para etiquetar correctamente su (s) objetivo (s) de interés. Las sondas de destino (Paso 5) tienen diferentes canales de color (C1, C2 o C3), que dictan su respectiva etiqueta fluorescente (Alexa 488, Atto 550 o Alexa 647), según el Amp 4-FL elegido. Los ejemplos de elección de combinaciones de fluoróforos para imágenes multiplexadas se proporcionan en las leyendas de la Figura 2 y la Figura 3. Como ejemplo adicional, la selección de Amp 4B-FL marcará selectivamente las sondas de ADN C1 con Atto 550 y las sondas de ARN C3 con Alexa 647.
<ol><li>Retire las guías del 1x tampón de lavado y toque / absorba para eliminar el exceso de líquido.</li>
	<li>Añade 1 gota de Amp 4-FL en el cubreobjetos. Incubar en horno humidificado a 40 °C durante 15 min. NOTA: Siguiendo el paso 9.2, mantenga las muestras cubiertas, protegidas de la luz.</li>
	<li>Decantar Amp 4-FL y sumergir en 1x tampón de lavado. Agitar meciendo el plato durante 2 minutos en RT. Repita el lavado con el nuevo tampón de lavado 1x. Lavar con 1x PBS (2 min) y almacenar en PBS.</li>
</ol>10. Inmunotinción de proteínas: Para etiquetar la(s) proteína(s) de interés
<ol><li>Decantar PBS y agregar 200 μL de tampón de bloqueo (1% p/v BSA, 10% v/v FBS en PBS con 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) al cubreobjetos. Incubar 1 h en RT.</li>
	<li>Decantar el tampón de bloqueo y aplicar 200 μL de anticuerpo primario diluido en PBST + 1% p/v BSA. Incubar 1 h en RT.</li>
	<li>Lave el portaobjetos dos veces con PBST durante 10 minutos en RT con agitación.</li>
	<li>Aplicar el anticuerpo secundario de elección durante 1 h en RT en PBST + 1% p/v BSA.</li>
	<li>Lave el portaobjetos con PBST durante 10 minutos en RT con agitación.</li>
</ol>11. Tinción nuclear: Núcleos contra tinción después de la inmunotinción
<ol><li>Decantar PBST y aplicar DAPI o tinción nuclear de elección durante 1 min en RT.</li>
	<li>Lave el portaobjetos dos veces con PBS durante 10 minutos en RT con agitación.</li>
</ol>12. Montaje
<ol><li>Coloque 1 gota de solución antidecoloración (por ejemplo, Prolong Gold) en un nuevo portaobjetos de vidrio estéril (primero, limpie el portaobjetos con EtOH y deje secar para asegurarse de que no haya residuos en el vidrio). Con la misma punta, extienda la gota de la solución antidecoloración para cubrir un área aproximadamente del tamaño del cubreobjetos. NOTA: La solución antidecoloración es muy viscosa y puede ser difícil de pipetear. Cortar la punta de una punta de 200 μL antes del pipeteo puede mitigar estos problemas.</li>
	<li>Retire el cubreobjetos con muestra de celda del portaobjetos y sumérjalo en PBS para eliminar el esmalte de uñas residual en la parte posterior utilizando los fórceps y PBS. Fórceps secos y parte posterior del cubreobjetos con un Kimwipe.</li>
	<li>Incruste suavemente el cubreobjetos en la gota de solución antidecoloración, colocando el lado de la muestra (lado con la capa celular) del cubreobjetos sobre la gota).</li>
	<li>Deje que las muestras se sequen durante la noche.</li>
</ol>13. Imágenes
<ol><li>Imagen con un microscopio epifluorescente.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zheng, Q., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+photostable+fluorophores+for+molecular+imaging.">Development of photostable fluorophores for molecular imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).</li><li>Marini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Puray-Chavez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-cell+visualization+of+nucleic+acids+and+protein+during+HIV+infection.">Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection.</a> Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).</li><li>Ukah, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+HIV-1+RNA+Transcription+from+Integrated+HIV-1+DNA+in+Reactivated+Latently+Infected+Cells.">Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells.</a> Viruses. 10 (10), (2018).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Positive+and+Negative+Sense+Viral+RNA+for+Probing+the+Mechanism+of+Direct-Acting+Antivirals+against+Hepatitis+C+Virus.">Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus.</a> Viruses. 11 (11), (2019).</li><li>Achuthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid-CPSF6+Interaction+Licenses+Nuclear+HIV-1+Trafficking+to+Sites+of+Viral+DNA+Integration.">Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Xia, C., Babcock, H. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+replication+complexes+accumulate+in+nuclear+speckles+and+integrate+into+speckle-associated+genomic+domains.">HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains.</a> Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).</li><li>Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+blockade+reveals+that+HIV-1+completes+reverse+transcription+and+uncoating+in+the+nucleus.">Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus.</a> Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La visualización simultánea de ARN, ADN y proteína a menudo requiere una optimización extensa. Dos métodos comúnmente utilizados son el etiquetado de 5-etinil-2-desoxiuridina (EdU) y DNA FISH. El etiquetado de EdU se ha aplicado para visualizar el ADN viral y la proteína simultáneamente, ya que EdU se incorpora en el ADN naciente y posteriormente se marca con colorantes fluorescentes que contienen azida a través de la química de clic. Por lo tanto, el etiquetado EdU se puede utilizar para monitorear la...

Si bien hay miles de anticuerpos comerciales disponibles para etiquetar específicamente las proteínas a través de enfoques convencionales de inmunotinción, y mientras que las proteínas de fusión se pueden diseñar con etiquetas fluorescentes fotooptimizadas para rastrear múltiples proteínas en una muestra1, la visualización microscópica de proteínas a menudo no es compatible con la hibridación in situ de fluorescencia de ADN convencional (FISH)2 . Las limitaciones técnicas en la visualización simultánea de ADN, ARN y proteínas utilizando enfoques basados en fluorescencia han obstaculizado la comprensión profunda de la replicación del virus. El seguimiento tanto del ácido nucleico viral como de la proteína durante el curso de la infección permite a los virólogos visualizar los procesos fundamentales que subyacen a la replicación y ensamblaje del virus 3,4,5,6.
Hemos desarrollado un enfoque de imagen, la detección dbasada en ml ultiplex immunofluorescent cell-based de DNA, RNA y Protein (MICDDRP)3, que utiliza la tecnología in situ de ADN ramificado (ADNb) para mejorar la sensibilidad de ladetección de ácidos nucleicos 7,8,9 . Además, este método utiliza sondas pareadas para mejorar la especificidad. Las sondas específicas de secuencia de ADNb utilizan ADN de preamplificador ramificado y amplificador para producir una señal intensa y localizada, mejorando los métodos de hibridación anteriores que se basaban en apuntar a regiones repetidas en el ADN9. Las células infectadas en un contexto clínico a menudo no contienen abundante material genético viral, proporcionando un producto para un método sensible para la detección de ácidos nucleicos fluorescentes en entornos de diagnóstico. La comercialización de la tecnología bDNA a través de enfoques como RNAscope7 y ViewRNA10 han llenado este nicho. La sensibilidad de las imágenes de fluorescencia de ADNb también tiene una utilidad importante en biología celular, permitiendo la detección de especies escasas de ácidos nucleicos en modelos de cultivo celular. La gran mejora de la sensibilidad hace que los métodos de imagen basados en ADNb sean adecuados para estudiar virus. Una deficiencia potencial, sin embargo, es que estos métodos se centran en la visualización de ARN o ARN y proteína. Todas las células replicantes y muchos virus tienen genomas de ADN o forman ADN durante su ciclo de replicación, lo que hace que los métodos capaces de obtener imágenes tanto de ARN como de ADN, así como proteínas, sean altamente deseables.
En el protocolo MICDDRP, realizamos bDNA FISH para la detección de ácido nucleico viral utilizando el método RNAscope, con modificaciones7. Una de las principales modificaciones de este protocolo es la optimización del tratamiento con proteasa después de la fijación química. El tratamiento con proteasa facilita la eliminación de proteínas unidas al ácido nucleico para mejorar la eficiencia de la hibridación de la sonda. El tratamiento con proteasa es seguido por la incubación con sondas de oligonucleótidos ramificados. Después de la aplicación de las sondas de ADNb, las muestras se lavan y posteriormente se incuban con ADN de preamplificador de señal y amplificador. La hibridación in situ multiplexada (ISH), el etiquetado de múltiples dianas génicas requiere sondas diana con diferentes canales de color para la diferenciación espectral7. La incubación con amplificadores de ADN es seguida por inmunofluorescencia (IF).
bDNA ISH imparte mejoras en la relación señal-ruido mediante la amplificación de señales específicas del objetivo, con una reducción del ruido de fondo de eventos de hibridación no específicos 7,11. Las sondas objetivo se diseñan utilizando programas de software disponibles públicamente que predicen la probabilidad de eventos de hibridación no específicos, así como calculan la temperatura de fusión (Tm) del híbrido sonda-objetivo 7,11. Las sondas objetivo contienen una región de 18 a 25 bases complementaria a la secuencia de ADN/ARN objetivo, una secuencia de espaciador y una secuencia de cola de 14 bases. Un par de sondas objetivo, cada una con una secuencia de cola distinta, se hibridan a una región objetivo (que abarca ~ 50 bases). Las dos secuencias de cola forman un sitio de hibridación para las sondas del preamplificador, que contienen 20 sitios de unión para las sondas del amplificador, que, además, contienen 20 sitios de unión para la sonda de etiqueta. Como ejemplo, una región de un kilobase (kb) en la molécula de ácido nucleico es objetivo de 20 pares de sondas, creando un andamio molecular para la hibridación secuencial con el preamplificador, el amplificador y la sonda de etiqueta. Por lo tanto, esto puede conducir a un rendimiento teórico de 8000 etiquetas fluorescentes por molécula de ácido nucleico, lo que permite la detección de moléculas individuales y grandes mejoras sobre los enfoques convencionales de FISH7 (Ver Figura 1A para el esquema de amplificación de señales de ADNb). Para configurar sondas para ISH multiplexado, cada sonda de destino debe estar en un canal de color diferente (C1, C2 o C3). Estas sondas objetivo con diferentes canales de color poseen distintas secuencias de cola de 14 bases. Estas secuencias de cola se unirán a distintos amplificadores de señal con diferentes sondas fluorescentes, lo que permitirá una fácil diferenciación espectral a través de múltiples objetivos. En el Protocolo presentado, la Tabla 4 en el Paso 9, proporciona más información sobre el etiquetado fluorescente de las sondas objetivo. Además, la Figura 2 y la Figura 3 proporcionan ejemplos de cómo elegimos el amplificador 4-FL (A, B o C) apropiado (sonda fluorescente y el paso final de hibridación) para lograr un etiquetado fluorescente específico de múltiples objetivos de ácido nucleico viral después de las infecciones por VIH-1 y HTLV-1.
Hemos demostrado varias aplicaciones de visualización simultánea de fluorescencia de ARN, ADN y proteínas, observando etapas críticas de replicación del virus con alta resolución espaciotemporal 3,4,5. Por ejemplo, la visualización simultánea de una sola célula de ARN viral, ADN citoplasmático y nuclear y proteínas nos ha permitido visualizar eventos clave durante la infección por VIH-1, incluido el seguimiento de núcleos que contienen ARN en el citoplasma antes de la entrada nuclear y la integración del ADN proviral3. Además, hemos aplicado MICDDRP para caracterizar los efectos de los factores del huésped y el tratamiento farmacológico sobre la infección viral y la replicación 4,5. En Ukah et al., rastreamos la reactivación de la transcripción del VIH-1 en modelos de células de latencia tratados con diferentes agentes de reversión de latencia para visualizar la transcripción del VIH y la reversión de la latencia4. Además, MICDDRP puede permitirnos visualizar cambios fenotípicos asociados con la inhibición antiviral atribuida al tratamiento de moléculas pequeñas o la restricción del factor huésped. Como prueba de concepto de la solidez y amplia aplicabilidad de nuestro enfoque, hemos demostrado que podemos utilizar modificaciones de nuestro protocolo para etiquetar eficientemente el ácido nucleico viral para seguir la infección no solo en el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-1, sino también en el virus linfotrópico T humano (HTLV)-1, el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC), Virus del Zika (ZIKV) y virus de la influenza A (IAV). Como el ciclo de vida del VIH-1 consiste en especies de ADN y ARN virales, hemos realizado la mayor parte de nuestra optimización de MICDDRP siguiendo la cinética de replicación del VIH-1. Sin embargo, además, hemos demostrado que podemos rastrear la síntesis de diferentes transcripciones de ARN viral de uno o ambos nervios de sentido (+) y antisentido (-) en virus como ZIKV, IAV, HBV y VHC para monitorear la transcripción y replicación viral 3,4,5,6. Los estudios tienen como objetivo mejorar la comprensión mecanicista de varios procesos virales y servir como guía para implementar esta tecnología de imágenes de fluorescencia en una amplia gama de modelos celulares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% dextran sulfate</td>
			<td>Amreso</td>
			<td>198</td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X wash buffer</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>320058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 1-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 2-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 3-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 4-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td>Consult Amp-4 table in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HCV NS5a antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13833</td>
			<td>Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mov10 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80613</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PB1 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX125923</td>
			<td>Antibody against flu protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking reagent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell media with supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Media appropriate for cell model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td>Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td>No calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E26258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand colorfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-17/18/19</td>
			<td>Precleaned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCV-GT2a-sense-C2 probe</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441371</td>
			<td>HCV(+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-gagpol-C1</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>317701</td>
			<td>HIV-1 cDNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-nongagpol-C3</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>317711-C</td>
			<td>HIV-1 RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ hybridization oven</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>321710/321720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-d-lysine (PDL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Coat coverslips in 20 &#181;g/mL of PDL for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe diluent</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>300041</td>
			<td>For diluting RNA C2 or C3 probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease III</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>322337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope&#174;&#160;Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>436221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate, pH 6.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer and PBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HBV-GTD</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441351</td>
			<td>Total HBV RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HBV-GTD-01-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>465531-C2</td>
			<td>HBV pgRNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HCV-GT2a probe</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441361</td>
			<td>HCV(-) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV-HBZ-sense-C3</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495071-C3</td>
			<td>HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV1-GAG-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495051-C2</td>
			<td>HTLV-1 DNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV1-GAG-POL-sense</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495061</td>
			<td>HTLV-1 (+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>436221</td>
			<td>IAV RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-ZIKA-pp-O2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>464531</td>
			<td>Zika(+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-ZIKA-pp-O2-sense-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>478731-C2</td>
			<td>Zika(-) sense RNA probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell multiplexed fluorescence imaging to visualize viral nucleic acids and proteins and monitor hiv, htlv, hbv, hcv, zika virus, and influenza infection

La captura de los procesos dinámicos de replicación y ensamblaje de virus se ha visto obstaculizada por la falta de tecnologías robustas de hibridación in situ (ISH) que permitan el etiquetado sensible y simultáneo de ácidos nucleicos y proteínas virales. Los métodos convencionales de hibridación in situ por fluorescencia de ADN (FISH) a menudo no son compatibles con la inmunotinción. Por lo tanto, hemos desarrollado un enfoque de imagen, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein), que permite la visualización simultánea de ADN, ARN y proteína en una sola célula. En comparación con los peces de ADN convencionales, MICDDRP utiliza la tecnología ISH de ADN ramificado (ADNb), que mejora drásticamente la sensibilidad y detección de la sonda de oligonucleótidos. Pequeñas modificaciones de MICDDRP permiten obtener imágenes de proteínas virales concomitantemente con ácidos nucleicos (ARN o ADN) de diferentes cadenas. Hemos aplicado estos protocolos para estudiar los ciclos de vida de múltiples patógenos virales, incluido el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)-1, el virus linfotrópico T humano (HTLV)-1, el virus de la hepatitis B (VHB), el virus de la hepatitis C (VHC), el virus del Zika (ZKV) y el virus de la influenza A (IAV). Demostramos que podemos etiquetar eficientemente los ácidos nucleicos y las proteínas virales en una amplia gama de virus. Estos estudios pueden proporcionarnos una mejor comprensión mecanicista de múltiples sistemas virales y, además, servir como plantilla para la aplicación de imágenes de fluorescencia multiplexada de ADN, ARN y proteínas en un amplio espectro de sistemas celulares.

Un esquema de MICDDRP se representa en la Figura 1. El etiquetado del ADN y el ARN es seguido por la inmunotinción. El uso de amplificadores de ramificación aumenta la señal, lo que permite la detección de moléculas individuales de ácido nucleico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61843/61843fig1v5.jpg"> Figura 1: Esquema de MICDDRP y flujo de trabajo paso a paso. (A) La...

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Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de imágenes de fluorescencia, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein (MICDDRP), un método capaz de la visualización simultánea de fluorescencia unicelular de proteínas virales y ácidos nucleicos de diferente tipo y varamiento. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de sistemas.

Imágenes de fluorescencia multiplexada de una sola célula para visualizar ácidos nucleicos y proteínas virales y monitorear el VIH, el HTLV, el VHB, el VHC, el virus del Zika y la infección por influenza

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

single-cell-multiplexed-fluorescence-imaging-to-visualize-viral

Research

JoVE Journal

Biology

2.7K vistas.  Emory University School of Medicine. Aquí se presenta un protocolo para un enfoque de imágenes de fluorescencia, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA y protein (MICDDRP), un método capaz de la visualización simultánea de fluorescencia unicelular de proteínas virales y ácidos nucleicos de diferente tipo y varamiento. Este enfoque se puede aplicar a una amplia ga...

Video: Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purificación y visualización de la gripe A ribonucleoprotein complejos virales

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Investigación

Biología

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Una técnica para visualizar simultáneamente específica para el virus las células CD8 + T y células infectadas por virus In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolumen cuantificación de ácidos nucleicos

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinación de la concentración de ácidos nucleicos y proteínas utilizando el micro-volumen Bio-spec Espectrofotómetro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Etiquetado específico de secuencia de ácidos nucleicos y proteínas con metiltransferasas y el cofactor Análogos

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

El aislamiento de filtración de ácidos nucleicos: A Extracción de ADN método sencillo y rápido

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

Proyección de imagen funcional de fábricas de transcripción Viral mediante microscopia de fluorescencia 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

Microaspiración de células únicas como estrategia alternativa a la clasificación celular activada por fluorescencia para la separación de mezclas de virus gigantes

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as epitranscriptomics. Among others, N6-methyladenosine (m6A) and 5-methylcytosine (m5C) RNA modifications have been described on mRNA molecules and may have a role in modulating cellular processes. Epitranscriptomics is thus a new layer of regulation that must be considered in addition to transcriptomic analyses, as it can also be altered or modulated by exposure to any chemical or biological agent, including viral infections.
Here, we present a workflow that allows analysis of the joint cellular and viral epitranscriptomic landscape of the m6A and m5C marks simultaneously, in cells infected or not with the human immunodeficiency virus (HIV). Upon mRNA isolation and fragmentation from HIV- infected and non-infected cells, we used two different procedures: MeRIP-Seq, an RNA immunoprecipitation-based technique, to enrich for RNA fragments containing the m6A mark and BS-Seq, a bisulfite conversion-based technique, to identify the m5C mark at a single nucleotide resolution. Upon methylation-specific capture, RNA libraries are prepared for high-throughput sequencing. We also developed a dedicated bioinformatics pipeline to identify differentially methylated (DM) transcripts independently from their basal expression profile.
Overall, the methodology allows exploration of multiple epitranscriptomic marks simultaneously and provides an atlas of DM transcripts upon viral infection or any other cell perturbation. This approach offers new opportunities to identify novel players and novel mechanisms of cell response, such as cellular factors promoting or restricting viral replication.

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in viral infections is just starting to be explored and could highlight new viral-host interaction mechanisms. In this work, we provide a pipeline to investigate m6A and m5C RNA modifications in the context of viral infections.

Explorando los epitrancrismos de m6A y m5C sobre la infección viral: un ejemplo con el VIH

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...