Questo lavoro è stato sostenuto in tutto o in parte dal National Institutes of Health (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 e U54 AI150472). Ringraziamo il Dr. Raymond F. Schinazi e Sadie Amichai per aver fornito cellule infette dal virus dell'influenza A.

1. Cellule seme (Suspension vs. Adherent Cells) su coverslip o vetrini da camera (il protocollo presentato utilizza coverslips).
<ol><li>Semina di celle di sospensione<ol><li>Preparare i coprivetrini rivestiti in poli-D-lisina (PDL) (facilita l'aderenza delle celle di sospensione al coverslip) incubando prima i coprivetrini in etanolo (EtOH) per 5 minuti (sterilizza i vetrini di copertura e rimuove eventuali residui). Quindi lavare 2 volte in soluzione salina tamponata fosfato (PBS) prima di incubare i vetrini di copertura in PDL (20 μg/ml) per 30 minuti (min) a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Rimuovere PDL e lavare 2 volte in PBS. Celle pellet (precedentemente infettate/trattate in base alle condizioni di imaging desiderate) e risospendere 106cellule in 50 μL di PBS. Spot 50 μL di cellule su vetro (rivestito PDL) e incubare a RT per 30 minuti.</li>
	</ol></li>
	<li>Semina di cellule aderenti<ol><li>Cellule di coltura su coprislip sterile posto in 6 pozzetti piatto e infettare le cellule con particelle virali o trattare con composto di interesse. Consentire alle cellule di raggiungere il 50-70% di confluenza prima della preparazione del campione per gli esperimenti di imaging.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fissazione cellulare: preservare la morfologia cellulare per gli studi di imaging a fluorescenza
NOTA: Mantenere il 4% di PFA e PBS a RT per almeno 30 minuti prima della fissazione cellulare.
<ol><li>Aspirare il supporto cellulare, lavare le cellule su coprivetrini 3 volte in PBS e fissare le cellule in paraformaldeide (PFA) al 4% per 30 minuti. Aspirare PFA e lavare le celle in PBS 2x. NOTA: Le cellule possono ora essere disidratate e conservate, se lo sperimentatore desidera riprendere l'esperimento in un'altra data. Le cellule fisse possono essere disidratate in EtOH prima dello stoccaggio.<ol><li>Rimuovere il PBS dopo il lavaggio dopo la fissazione cellulare e sostituirlo con 500 μL di EtOH al 50% (v/v in acqua). Incubare a RT per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere il 50% di EtOH e sostituirlo con 500 μL di 70% di EtOH. Incubare a RT per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere il 70% di EtOH e sostituirlo con 500 μL di 100% di EtOH. Incubare a RT per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere 100% EtOH e sostituirlo con fresco 100% EtOH. NOTA: Le cellule disidratate possono essere conservate a -20 °C per 6 mesi. Sigillare le piastre con nastro adesivo o parafilm prima dello stoccaggio per evitare l'evaporazione di EtOH.</li>
		<li>Reidratare le cellule per passare all'etichettatura a fluorescenza multipla di cellule/virus.</li>
		<li>Rimuovere il 100% EtOH e sostituirlo con 500 μL di 70% di EtOH. Incubare a RT per 2 min. NOTA: Non lasciare asciugare le cellule in qualsiasi momento. Utilizzare sempre una soluzione sufficiente per immergere tutte le celle.</li>
		<li>Rimuovere il 70% di EtOH e sostituirlo con 500 μL di 50% di EtOH. Incubare a RT per 2 min.</li>
		<li>Rimuovere il 50% di EtOH e sostituirlo con 1x PBS. NOTA: Preparare la diluizione della proteasi, le sonde di ibridazione e il tampone di lavaggio prima del trattamento con proteasi (Fase 4) e dell'applicazione della sonda target (Fase 5). Istruzioni specifiche sulla preparazione del reagente sono presentate all'inizio di ogni rispettiva fase.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagenti</td>
			<td>Altre note</td>
		</tr><tr><td>Soluzione di proteasi</td>
			<td>Preparazione in 1X PBS</td>
		</tr><tr><td>Sonda(e) oligonucletodie bersaglio</td>
			<td>Diluire in tampone di ibridazione</td>
		</tr><tr><td>Tampone di lavaggio</td>
			<td>Lavaggi seguendo le fasi di ibridazione target</td>
		</tr><tr><td>Buffer di ibridazione</td>
			<td>Ricetta presentata nella tabella 3</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Reagenti chiave nel protocollo MICDDDRP.
3. Permeabilizzazione cellulare: aumenta l'accesso alla cellula e agli organelli cellulari per l'ingresso di grandi molecole (anticorpi, sonde di ibridazione degli acidi nucleici)
<ol><li>Rimuovere 1x PBS dopo la fissazione cellulare o la reidratazione e sostituirlo con 500 μL di 0,1% (v/v) Tween-20 in 1x PBS. Incubare a RT per 10 min. Sostituisci uno per uno. Lavare una volta con 500 μL di 1x PBS e aggiungere 1x PBS fresco.</li>
</ol>4. Immobilizzazione del coverslip su vetrino e trattamento con proteasi per rimuovere le proteine leganti gli acidi nucleici dall'acido nucleico virale/cellulare fisso per migliorare l'efficienza di ibridazione
NOTA: Preparare la soluzione diluita di Proteasi III (vedere le specifiche del reagente nella Tabella dei materiali) durante la permeabilizzazione cellulare. Lasciare che la proteasi raggiunga RT per 10 minuti prima della permeabilizzazione.
<ol><li>Metti una piccola goccia di smalto su un vetrino sterilizzato. Asciugare la schiena (lato senza strato cellulare) e posizionare il bordo della copertina sulla goccia di smalto, con il lato con le cellule aderenti rivolte verso l'alto. Aggiungere alcune gocce di PBS sul coprislip immobilizzato per evitare l'essiccazione.<ol><li>Disegnare un cerchio (a circa 3 mm di distanza dal coprivetrino) attorno al perimetro del coprivetrino ora aderente al vetrino utilizzando una penna barriera idrofobica (penna idrorepellente che mantiene i reagenti localizzati sulle cellule).</li>
	</ol></li>
	<li>Diluire Proteasi III in 1x PBS (100 μL/coverslip). NOTA: Potrebbe essere necessario regolare la concentrazione della proteasi in base alle differenze nei tipi di cellule, nelle sonde o negli acidi nucleici bersaglio attraverso l'ottimizzazione empirica (vedi discussione). Per una marcatura più efficiente di RNA / DNA in diversi sistemi virali, abbiamo avuto successo con le seguenti diluizioni presentate nella Tabella 2 di seguito con diluizioni che vanno da (1 a 2 ) - (da 1 a 15) (proteasi a 1x PBS).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Target della sonda</td>
			<td>Diluizione della proteasi in 1X PBS (da Proteasi III a 1X PBS)</td>
		</tr><tr><td>HIV-1 DNA/RNA</td>
			<td>1 a 5</td>
		</tr><tr><td>HTLV-1 DNA/RNA</td>
			<td>1 a 5</td>
		</tr><tr><td>pgRNA HBV e RNA HBV totale</td>
			<td>1 a 15</td>
		</tr><tr><td>IAV RNA</td>
			<td>1 a 15</td>
		</tr><tr><td>ZIKV RNA</td>
			<td>1 a 2</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 2: Diluizioni della proteasi III nella PBS per l'ibridazione dell'acido nucleico virale.
<ol start="3"><li>Decantare il PBS 1x sul vetrino dopo l'immobilizzazione e applicare la Proteasi III diluita.</li>
	<li>Incubare in forno umidificato a 40 °C per 15 min.</li>
	<li>Decantare la soluzione di proteasi e immergere i vetrini in 1x PBS. Agitare con un piatto a dondolo per 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo 1x PBS.<ol><li>Per il solo rilevamento del DNA, lavare i campioni tre volte con acqua priva di nucleasi per 2 minuti ciascuno, seguita da incubazione con 5 mg/ml di RNasi A diluita in PBS per 30 minuti a 37 °C.</li>
		<li>Decantare la soluzione RNase A e lavare 3 volte per 2 minuti con acqua ultrapura. Continuare con ISH della/e sonda/e target/e. NOTA: Il buffer di ibridazione migliora il rilevamento del vDNA senza influire sull'efficienza di colorazione del vRNA per i risultati presentati (Risultati rappresentativi). Sonde diluite DNA Channel 1 (C1) 1:1 con sonda di ibridazione. Sonde di RNA C2 e C3 diluite in tampone di ibridazione. Le sonde C2 e C3 utilizzate nei nostri studi di imaging sono in soluzioni 50X (1:50; sonda target al buffer di ibridazione).</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare il tampone di ibridazione in acqua priva di nucleasi seguendo la procedura passo-passo riportata di seguito:<ol><li>In una provetta da 15 ml, aggiungere 700 μL di acqua esente da nucleasi, 300 μL del 50% (peso/volume (p/v)) di destrano solfato, 300 μL di 5 M NaCl, 125 μL di 200 mM di citrato di sodio (pH 6,2) e 375 mg (polvere) di carbonato di etilene.</li>
		<li>Mescolare bene usando un vortice per sciogliere il carbonato di etilene (assicurarsi che tutta la polvere sia disciolta e la soluzione limpida).</li>
		<li>Aggiungere 25 μL del 10% (volume/volume (v/v)) Tween-20 e abbastanza acqua priva di nucleasi per completare 2,5 mL (2x soluzione). NOTA: La ricetta per il buffer di ibridazione presentata può essere trovata nella tabella 3 di seguito. La soluzione è stabile per una settimana. Garantire una miscelazione sufficiente del detergente Tween-20, facendo attenzione a prevenire il gorgogliamento della soluzione.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagente</td>
			<td>Concentrazione delle scorte</td>
			<td>Note aggiuntive</td>
		</tr><tr><td>Acqua esente da nucleasi</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Destrano solfato</td>
			<td>50% (w/v)</td>
			<td>Molto viscoso</td>
		</tr><tr><td>Cloruro di sodio</td>
			<td>5 metri</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Citrato di sodio (pH 6,2)</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>Conservare a 4 °C</td>
		</tr><tr><td>Carbonato di etilene</td>
			<td>NA</td>
			<td>Polvere</td>
		</tr><tr><td>Tween-20</td>
			<td>10% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabella 3: Elenco dei reagenti del buffer di ibridazione.
5. Incubazione con sonde di ibridazione bersaglio DNA/RNA: le sonde oligonucleotidiche target si legano alle regioni di interesse, creando un'impalcatura molecolare per preamplificatori, amplificatori e sonde fluorescenti da legare.
NOTA: Sonde DNA/RNA calde a 40 °C per 10 minuti (durante la permeabilizzazione cellulare) e raffreddare a RT per almeno 10 minuti, se non è incluso alcun trattamento con RNasi. Se è necessario un trattamento con RNasi o un ulteriore trattamento del campione prima dell'ibridazione della sonda bersaglio, riscaldare le sonde di conseguenza. Ruotare le sonde C2 e C3 dopo il riscaldamento e diluirle in tampone di ibridazione. Dopo la diluizione, le sonde C2 e C3 possono essere brevemente riscaldate. Tampone di lavaggio caldo 50x (vedere la tabella dei materiali per maggiori dettagli) a 40 °C per 10-20 minuti e diluire a 1x in acqua di biologia molecolare.
<ol><li>Incubare 200 μL del tampone di ibridazione a 67 °C per 10 minuti prima dell'aggiunta della o delle sonde di ibridazione. Sonda diluita in tampone di ibridazione (ricetta elencata nella Tabella 2). Aggiungere 50 μL/coprifoglio.</li>
	<li>Incubare in forno umidificato a 40 °C per 2 ore (h). Decantare le sonde e immergere i vetrini in 1x tampone di lavaggio. Agitare dondolando per 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x.</li>
</ol>6. Ibridazione amplificatore (amp) 1-FL: aggiunta di preamplificatore complementare alla sequenza di coda delle sonde DNA/RNA bersaglio (Fase 5)
NOTA: Gli amplificatori devono essere a RT prima dell'uso. Estrarre ogni singolo amplificatore dal frigo 30 minuti prima dell'uso e lasciare sul banco a RT.
<ol><li>Rimuovere i vetrini dal tampone di lavaggio 1x e toccare/assorbire per rimuovere il liquido in eccesso.</li>
	<li>Aggiungere 1 goccia di Amp 1-FL sul foglietto. Incubare in forno umidificato a 40 °C per 30 min.</li>
	<li>Decantare Amp 1-FL e immergere in 1x tampone di lavaggio. Agitare con un piatto a dondolo 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x.</li>
</ol>7. Ibridazione Amp 2-FL: Incubazione con amplificatore di segnale con sequenza di riconoscimento affine ai preamplificatori (Amp 1-FL)
<ol><li>Rimuovere i vetrini dal tampone di lavaggio 1x e toccare/assorbire per rimuovere il liquido in eccesso.</li>
	<li>Aggiungere 1 goccia di Amp 2-FL sulla copertina. Incubare in forno umidificato a 40 °C per 15 min.</li>
	<li>Decantare Amp 2-FL e immergere in 1x tampone di lavaggio. Agitare con un piatto a dondolo 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x.</li>
</ol>8. Ibridazione Amp 3-FL: Incubazione con secondo amplificatore di segnale
<ol><li>Rimuovere i vetrini dal tampone di lavaggio 1x e toccare/assorbire per rimuovere il liquido in eccesso.</li>
	<li>Aggiungere 1 goccia di Amp 3-FL sul coprifoglio. Incubare in forno umidificato a 40 °C per 30 min.</li>
	<li>Decantare Amp 3-FL e immergere in 1x tampone di lavaggio. Agitare con un piatto a dondolo 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x.</li>
</ol>9. Ibridazione Amp 4-FL: etichetta fluorescente e fase finale di ibridazione
NOTA: Per prima cosa, vedere la Tabella 4 per scegliere l'amplificatore 4 (A, B o C)- FL adatto in base ai canali della sonda o delle sonde target. Valutare quale Amp 4-FL è necessario per etichettare DNA / RNA di interesse. Un esempio è fornito dalla tabella seguente:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Un</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td>Canale del DNA 1 (C1)</td>
			<td>488</td>
			<td>550</td>
			<td>550</td>
		</tr><tr><td>DNA/RNA Canale 2 (C2)</td>
			<td>550</td>
			<td>488</td>
			<td>647</td>
		</tr><tr><td>RNA Canale 3 (C3)</td>
			<td>647</td>
			<td>647</td>
			<td>488</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 4: Selezione della sonda fluorescente Amp 4 (A, B o C)-FL per ISH multiplexato.
NOTA: Per FISH multiplexati (target multipli), la scelta dell'Amp 4 corretto (A, B o C)- FL è fondamentale per etichettare correttamente il target di interesse. Le sonde target (Step 5) hanno canali di colore diversi (C1, C2 o C3), che dettano la rispettiva etichetta fluorescente (Alexa 488, Atto 550 o Alexa 647), in base all'amplificatore 4-FL scelto. Esempi di scelta di combinazioni di fluorofori per l'imaging multiplex sono forniti nelle legende della Figura 2 e della Figura 3. Come ulteriore esempio, la selezione di Amp 4B-FL etichetterà selettivamente le sonde DNA C1 con Atto 550 e le sonde RNA C3 con Alexa 647.
<ol><li>Rimuovere i vetrini dal tampone di lavaggio 1x e toccare/assorbire per rimuovere il liquido in eccesso.</li>
	<li>Aggiungere 1 goccia di Amp 4-FL sulla copertina. Incubare in forno umidificato a 40 °C per 15 min. NOTA: dopo il passaggio 9.2, tenere i campioni coperti, al riparo dalla luce.</li>
	<li>Decantare Amp 4-FL e immergere in 1x tampone di lavaggio. Agitare dondolando per 2 minuti a RT. Ripetere il lavaggio con il nuovo tampone di lavaggio 1x. Lavare con 1x PBS (2 min) e conservare in PBS.</li>
</ol>10. Immunocolorazione proteica: per etichettare le proteine di interesse
<ol><li>Decantare PBS e aggiungere 200 μL di tampone bloccante (1% p/v BSA, 10% v/v FBS in PBS con 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) al coprifoglio. Incubare 1 ora a RT.</li>
	<li>Decantare tampone bloccante e applicare 200 μL di anticorpo primario diluito in PBST + 1% p/v BSA. Incubare 1 ora a RT.</li>
	<li>Lavare il vetrino due volte con PBST per 10 minuti a RT agitando.</li>
	<li>Applicare l'anticorpo secondario di scelta per 1 ora a RT in PBST + 1% w/v BSA.</li>
	<li>Lavare il vetrino con PBST per 10 minuti a RT agitando.</li>
</ol>11. Colorazione nucleare: nuclei contro-colorazione dopo immunocolorazione
<ol><li>Decantare PBST e applicare DAPI o colorazione nucleare di scelta per 1 minuto a RT.</li>
	<li>Lavare il vetrino due volte con PBS per 10 minuti a RT agitando.</li>
</ol>12. Montaggio
<ol><li>Posizionare 1 goccia di soluzione antisbiadimento (ad esempio, Prolong Gold) su un nuovo vetrino sterile (in primo luogo, pulire il vetrino con EtOH e lasciare asciugare per assicurarsi che non ci siano residui sul vetro). Con la stessa punta, distribuire la goccia di soluzione antisbiadimento per coprire un'area approssimativamente delle dimensioni del vetrino. NOTA: la soluzione antisbiadimento è molto viscosa e può essere difficile da pipettare. Tagliare la punta di una punta da 200 μL prima del pipettaggio può mitigare questi problemi.</li>
	<li>Rimuovere il coprislip con il campione di cellule dal vetrino e immergerlo in PBS per rimuovere lo smalto residuo sul retro usando la pinza e il PBS. Pinza asciutta e retro della copertina usando un Kimwipe.</li>
	<li>Incorporare delicatamente il coprislip nella goccia della soluzione antisbiadimento, posizionando il lato del campione (lato con lo strato cellulare) del coprislip sulla goccia).</li>
	<li>Lasciare asciugare i campioni durante la notte.</li>
</ol>13. Imaging
<ol><li>Immagine con un microscopio epifluorescente.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zheng, Q., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+photostable+fluorophores+for+molecular+imaging.">Development of photostable fluorophores for molecular imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).</li><li>Marini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Puray-Chavez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-cell+visualization+of+nucleic+acids+and+protein+during+HIV+infection.">Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection.</a> Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).</li><li>Ukah, O. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+replication+complexes+accumulate+in+nuclear+speckles+and+integrate+into+speckle-associated+genomic+domains.">HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains.</a> Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).</li><li>Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+blockade+reveals+that+HIV-1+completes+reverse+transcription+and+uncoating+in+the+nucleus.">Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus.</a> Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La visualizzazione simultanea di RNA, DNA e proteine richiede spesso un'ampia ottimizzazione. Due metodi comunemente usati sono l'etichettatura con 5-etinil-2-deossiuridina (EdU) e DNA FISH. L'etichettatura EdU è stata applicata per visualizzare simultaneamente DNA virale e proteine, poiché l'EdU è incorporato nel DNA nascente e successivamente etichettato con coloranti fluorescenti contenenti azoturo tramite chimica a clic. L'etichettatura EdU può quindi essere utilizzata per monitorare la cinetica di repli...

Mentre migliaia di anticorpi commerciali sono disponibili per marcare specificamente le proteine tramite approcci convenzionali di immunocolorazione, e mentre le proteine di fusione possono essere progettate con tag fluorescenti foto-ottimizzati per tracciare più proteine in un campione1, la visualizzazione microscopica delle proteine spesso non è compatibile con l'ibridazione convenzionale della fluorescenza del DNA in situ (FISH)2 . Le limitazioni tecniche nella visualizzazione simultanea di DNA, RNA e proteine utilizzando approcci basati sulla fluorescenza hanno ostacolato una comprensione approfondita della replicazione del virus. Il monitoraggio sia dell'acido nucleico virale che delle proteine durante il corso dell'infezione consente ai virologi di visualizzare i processi fondamentali che sono alla base della replicazione e dell'assemblaggio del virus 3,4,5,6.
Abbiamo sviluppato un approccio di imaging, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and Protein (MICDDRP)3, che utilizza la tecnologia in situ del DNA ramificato (bDNA) per migliorare la sensibilità del rilevamento degli acidi nucleici 7,8,9 . Inoltre, questo metodo utilizza sonde accoppiate per una maggiore specificità. Le sonde specifiche per la sequenza di bDNA utilizzano DNA di preamplificatori ramificati e amplificatori per produrre un segnale intenso e localizzato, migliorando i precedenti metodi di ibridazione che si basavano sul targeting di regioni ripetute nel DNA9. Le cellule infette in un contesto clinico spesso non contengono abbondante materiale genetico virale, fornendo una merce per un metodo sensibile per il rilevamento di acidi nucleici fluorescenti in contesti diagnostici. La commercializzazione della tecnologia del bDNA attraverso approcci come RNAscope7 e ViewRNA10 ha riempito questa nicchia. La sensibilità dell'imaging a fluorescenza del bDNA ha anche un'importante utilità nella biologia cellulare, consentendo il rilevamento di scarse specie di acidi nucleici in modelli di coltura cellulare. Il grande miglioramento della sensibilità rende i metodi di imaging basati sul bDNA adatti allo studio dei virus. Una potenziale carenza, tuttavia, è che questi metodi si concentrano sulla visualizzazione di RNA o RNA e proteine. Tutte le cellule replicanti e molti virus hanno genomi di DNA o formano DNA durante il loro ciclo di replicazione, rendendo altamente desiderabili metodi in grado di visualizzare sia l'RNA e il DNA, sia le proteine.
Nel protocollo MICDDRP, eseguiamo bDNA FISH per la rilevazione di acido nucleico virale utilizzando il metodo RNAscope, con modifiche7. Una delle principali modifiche a questo protocollo è l'ottimizzazione del trattamento della proteasi dopo la fissazione chimica. Il trattamento con proteasi facilita la rimozione delle proteine legate all'acido nucleico per migliorare l'efficienza di ibridazione della sonda. Il trattamento con proteasi è seguito dall'incubazione con sonde oligonucleotidiche ramificate. Dopo l'applicazione di sonde bDNA, i campioni vengono lavati e successivamente incubati con DNA di preamplificatore di segnale e amplificatore. L'ibridazione multiplexata in situ (ISH), marcatura di bersagli genici multipli, richiede sonde bersaglio con diversi canali di colore per la differenziazione spettrale7. L'incubazione con amplificatori del DNA è seguita da immunofluorescenza (IF).
bDNA ISH impartisce miglioramenti nel rapporto segnale-rumore mediante amplificazione di segnali target-specifici, con una riduzione del rumore di fondo da eventi di ibridazione non specifici 7,11. Le sonde target sono progettate utilizzando programmi software disponibili pubblicamente che prevedono la probabilità di eventi di ibridazione non specifici, oltre a calcolare la temperatura di fusione (Tm) dell'ibrido sonda-bersaglio 7,11. Le sonde bersaglio contengono una regione da 18 a 25 basi complementare alla sequenza DNA/RNA bersaglio, una sequenza distanziatrice e una sequenza di coda a 14 basi. Una coppia di sonde bersaglio, ciascuna con una sequenza di coda distinta, si ibridano in una regione bersaglio (che copre ~ 50 basi). Le due sequenze di coda formano un sito di ibridazione per le sonde preamplificatore, che contengono 20 siti di legame per le sonde amplificatore, che contengono inoltre 20 siti di legame per la sonda di etichetta. Ad esempio, una regione di una kilobase (kb) sulla molecola di acido nucleico è presa di mira da 20 coppie di sonde, creando un'impalcatura molecolare per l'ibridazione sequenziale con il preamplificatore, l'amplificatore e la sonda di etichetta. Ciò può quindi portare a una resa teorica di 8000 etichette fluorescenti per molecola di acido nucleico, consentendo il rilevamento di singole molecole e grandi miglioramenti rispetto agli approcci convenzionali FISH7 (vedi Figura 1A per lo schema dell'amplificazione del segnale bDNA). Per impostare le sonde per ISH multiplexato, ogni sonda target deve trovarsi in un canale di colore diverso (C1, C2 o C3). Queste sonde target con diversi canali di colore possiedono distinte sequenze di coda a 14 basi. Queste sequenze di coda collegheranno amplificatori di segnale distinti con diverse sonde fluorescenti, consentendo così una facile differenziazione spettrale su più bersagli. Nel protocollo presentato, la tabella 4 nella fase 9, fornisce ulteriori informazioni sull'etichettatura fluorescente delle sonde target. Inoltre, la Figura 2 e la Figura 3 forniscono esempi di come abbiamo scelto l'amplificatore 4-FL appropriato (A, B o C) (sonda fluorescente e fase finale di ibridazione) per ottenere una marcatura fluorescente specifica di più bersagli virali di acidi nucleici dopo infezioni da HIV-1 e HTLV-1.
Abbiamo dimostrato diverse applicazioni della visualizzazione simultanea della fluorescenza di RNA, DNA e proteine, osservando le fasi critiche della replicazione del virus con alta risoluzione spaziotemporale 3,4,5. Ad esempio, la visualizzazione simultanea di RNA virale, DNA citoplasmatico e nucleare e proteine ci ha permesso di visualizzare eventi chiave durante l'infezione da HIV-1, incluso il seguito di nuclei contenenti RNA nel citoplasma prima dell'ingresso nucleare e dell'integrazione del DNA provirale3. Inoltre, abbiamo applicato MICDDRP per caratterizzare gli effetti dei fattori dell'ospite e del trattamento farmacologico sull'infezione virale e sulla replicazione 4,5. In Ukah et al., abbiamo monitorato la riattivazione della trascrizione dell'HIV-1 in modelli cellulari di latenza trattati con diversi agenti di inversione della latenza per visualizzare la trascrizione dell'HIV e l'inversione della latenza4. Inoltre, MICDDRP può permetterci di visualizzare i cambiamenti fenotipici associati all'inibizione antivirale attribuita al trattamento con piccole molecole o alla restrizione del fattore ospite. Come prova di concetto per la robustezza e l'ampia applicabilità del nostro approccio, abbiamo dimostrato che possiamo utilizzare le modifiche del nostro protocollo per etichettare in modo efficiente l'acido nucleico virale per seguire l'infezione non solo nel virus dell'immunodeficienza umana (HIV)-1, ma anche nel virus T-linfotropico umano (HTLV)-1, nel virus dell'epatite B (HBV), nel virus dell'epatite C (HCV), Virus Zika (ZIKV) e virus dell'influenza A (IAV). Poiché il ciclo di vita dell'HIV-1 è costituito sia da DNA virale che da specie di RNA, abbiamo eseguito la maggior parte della nostra ottimizzazione di MICDDRP seguendo la cinetica di replicazione dell'HIV-1. Tuttavia, in aggiunta, abbiamo dimostrato che possiamo tracciare la sintesi di diversi trascritti di RNA virale di uno o entrambi i filamenti senso (+) e antisenso (-) in virus come ZIKV, IAV, HBV e HCV per monitorare la trascrizione virale e la replicazione 3,4,5,6. Gli studi mirano a migliorare la comprensione meccanicistica di diversi processi virali e servono come linea guida per implementare questa tecnologia di imaging a fluorescenza in una vasta gamma di modelli cellulari.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% dextran sulfate</td>
			<td>Amreso</td>
			<td>198</td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X wash buffer</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>320058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 1-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 2-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 3-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 4-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td>Consult Amp-4 table in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HCV NS5a antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13833</td>
			<td>Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mov10 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80613</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PB1 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX125923</td>
			<td>Antibody against flu protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking reagent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell media with supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Media appropriate for cell model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td>Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td>No calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E26258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand colorfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-17/18/19</td>
			<td>Precleaned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCV-GT2a-sense-C2 probe</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441371</td>
			<td>HCV(+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-gagpol-C1</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>317701</td>
			<td>HIV-1 cDNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-nongagpol-C3</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>317711-C</td>
			<td>HIV-1 RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ hybridization oven</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>321710/321720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-d-lysine (PDL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Coat coverslips in 20 &#181;g/mL of PDL for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe diluent</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>300041</td>
			<td>For diluting RNA C2 or C3 probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease III</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>322337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope&#174;&#160;Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>436221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate, pH 6.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer and PBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HBV-GTD</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441351</td>
			<td>Total HBV RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HBV-GTD-01-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>465531-C2</td>
			<td>HBV pgRNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HCV-GT2a probe</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441361</td>
			<td>HCV(-) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV-HBZ-sense-C3</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495071-C3</td>
			<td>HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV1-GAG-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495051-C2</td>
			<td>HTLV-1 DNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV1-GAG-POL-sense</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495061</td>
			<td>HTLV-1 (+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>436221</td>
			<td>IAV RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-ZIKA-pp-O2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>464531</td>
			<td>Zika(+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-ZIKA-pp-O2-sense-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>478731-C2</td>
			<td>Zika(-) sense RNA probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell multiplexed fluorescence imaging to visualize viral nucleic acids and proteins and monitor hiv, htlv, hbv, hcv, zika virus, and influenza infection

L'acquisizione dei processi di replicazione dinamica e assemblaggio dei virus è stata ostacolata dalla mancanza di robuste tecnologie di ibridazione in situ (ISH) che consentano la marcatura sensibile e simultanea dell'acido nucleico virale e delle proteine. I metodi convenzionali di ibridazione in situ a fluorescenza del DNA (FISH) spesso non sono compatibili con l'immunocolorazione. Abbiamo quindi sviluppato un approccio di imaging, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA and protein), che consente la visualizzazione simultanea di DNA, RNA e proteine. Rispetto al DNA FISH convenzionale, MICDDRP utilizza la tecnologia ISH del DNA ramificato (bDNA), che migliora notevolmente la sensibilità e il rilevamento della sonda oligonucleotidica. Piccole modifiche di MICDDRP consentono l'imaging di proteine virali in concomitanza con acidi nucleici (RNA o DNA) di diversa filamento. Abbiamo applicato questi protocolli per studiare i cicli di vita di più patogeni virali, tra cui il virus dell'immunodeficienza umana (HIV)-1, il virus T-linfotropico umano (HTLV)-1, il virus dell'epatite B (HBV), il virus dell'epatite C (HCV), il virus Zika (ZKV) e il virus dell'influenza A (IAV). Abbiamo dimostrato che possiamo etichettare in modo efficiente gli acidi nucleici virali e le proteine in una vasta gamma di virus. Questi studi possono fornirci una migliore comprensione meccanicistica di più sistemi virali e, inoltre, servire come modello per l'applicazione dell'imaging a fluorescenza multipla di DNA, RNA e proteine in un ampio spettro di sistemi cellulari.

Uno schema di MICDDRP è illustrato nella Figura 1. L'etichettatura del DNA e dell'RNA è seguita dall'immunocolorazione. L'uso di amplificatori ramificati aumenta il segnale, consentendo la rilevazione di singole molecole di acido nucleico.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61843/61843fig1v5.jpg"> Figura 1: Schema di MICDDRP e flusso di lavoro passo-passo. (A) Il segnale bDNA...

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Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Presentato qui un protocollo per un approccio di imaging a fluorescenza, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), un metodo in grado di visualizzare simultaneamente fluorescenza singola cellula di proteine virali e acidi nucleici di diverso tipo e filamento. Questo approccio può essere applicato a una vasta gamma di sistemi.

Imaging a fluorescenza multiplexata a singola cellula per visualizzare acidi nucleici e proteine virali e monitorare HIV, HTLV, HBV, HCV, virus Zika e infezione influenzale

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

single-cell-multiplexed-fluorescence-imaging-to-visualize-viral

Research

JoVE Journal

Biology

2.7K Views.  Emory University School of Medicine. Presentato qui un protocollo per un approccio di imaging a fluorescenza, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), un metodo in grado di visualizzare simultaneamente fluorescenza singola cellula di proteine virali e acidi nucleici di diverso tipo e filamento. Questo approccio può essere applicato a una vasta gam...

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Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Purificazione e visualizzazione di influenza A Complessi Ribonucleoproteina virale

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

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Biologia

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Una tecnica di visualizzare contemporaneamente Virus specifiche cellule CD8 + T e cellule infettate da virus In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop microvolumi quantificazione degli acidi nucleici

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Determinazione concentrazione di acidi nucleici e proteine ​​Utilizzando il Micro-volume Bio-spec Spettrofotometro Nano

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Anticorpo Microarray chimicamente bloccato per Multiplexed high-throughput Profiling di glicosilazione delle proteine ​​specifico in campioni complessi

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Specifici Sequenza Etichettatura degli acidi nucleici e proteine ​​con metiltransferasi e cofattore Analoghi

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

L&#39;isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

Imaging funzionale delle fabbriche di trascrizione virale utilizzando la microscopia a fluorescenza 3D

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

Micro-aspirazione a cella singola come strategia alternativa per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per la separazione delle miscele di virus giganti

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as epitranscriptomics. Among others, N6-methyladenosine (m6A) and 5-methylcytosine (m5C) RNA modifications have been described on mRNA molecules and may have a role in modulating cellular processes. Epitranscriptomics is thus a new layer of regulation that must be considered in addition to transcriptomic analyses, as it can also be altered or modulated by exposure to any chemical or biological agent, including viral infections.
Here, we present a workflow that allows analysis of the joint cellular and viral epitranscriptomic landscape of the m6A and m5C marks simultaneously, in cells infected or not with the human immunodeficiency virus (HIV). Upon mRNA isolation and fragmentation from HIV- infected and non-infected cells, we used two different procedures: MeRIP-Seq, an RNA immunoprecipitation-based technique, to enrich for RNA fragments containing the m6A mark and BS-Seq, a bisulfite conversion-based technique, to identify the m5C mark at a single nucleotide resolution. Upon methylation-specific capture, RNA libraries are prepared for high-throughput sequencing. We also developed a dedicated bioinformatics pipeline to identify differentially methylated (DM) transcripts independently from their basal expression profile.
Overall, the methodology allows exploration of multiple epitranscriptomic marks simultaneously and provides an atlas of DM transcripts upon viral infection or any other cell perturbation. This approach offers new opportunities to identify novel players and novel mechanisms of cell response, such as cellular factors promoting or restricting viral replication.

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in viral infections is just starting to be explored and could highlight new viral-host interaction mechanisms. In this work, we provide a pipeline to investigate m6A and m5C RNA modifications in the context of viral infections.

Esplorare gli epitrascrittomi m6A e m5C sull'infezione virale: un esempio di HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...