Diese Arbeit wurde ganz oder teilweise von den National Institutes of Health unterstützt (R01 AI121315, R01 AI146017, R01 AI148382, R01 AI120860, R37 AI076119 und U54 AI150472). Wir danken Dr. Raymond F. Schinazi und Sadie Amichai für die Bereitstellung von Zellen, die mit dem Influenza-A-Virus infiziert sind.

1. Samenzellen (Suspension vs. Adhärent Cells) auf Deckgläsern oder Kammerobjektträgern (vorgestelltes Protokoll verwendet Deckgläser).
<ol><li>Aussaat von Suspensionszellen<ol><li>Bereiten Sie mit Poly-D-Lysin (PDL) beschichtete Deckgläser vor (erleichtert die Anhaftung von Suspensionszellen an Deckglas), indem Sie zuerst Deckgläser in Ethanol (EtOH) für 5 Minuten inkubieren (sterilisiert Deckgläser und entfernt alle Rückstände). Anschließend 2x in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) waschen, bevor Deckgläser in PDL (20 μg/ml) für 30 Minuten (min) bei Raumtemperatur (RT) inkubiert werden.</li>
		<li>PDL entfernen und 2x in PBS waschen. Pelletzellen (zuvor infiziert/behandelt basierend auf den gewünschten Bildgebungsbedingungen) und resuspendieren 106Zellen in 50 μL PBS. 50 μL Zellen auf Glas (PDL-beschichtet) eintauchen und bei RT 30 min inkubieren.</li>
	</ol></li>
	<li>Aussaat von adhärenten Zellen<ol><li>Kulturzellen auf sterilem Deckglas in 6-Well-Schale und infizieren Zellen mit viralen Partikeln oder behandeln mit Verbindung von Interesse. Lassen Sie die Zellen vor der Probenvorbereitung für bildgebende Experimente eine Konfluenz von 50-70% erreichen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Zelluläre Fixierung: Zur Erhaltung der Zellmorphologie für Fluoreszenzbildgebungsstudien
HINWEIS: Halten Sie 4% PFA und PBS mindestens 30 Minuten vor der zellulären Fixierung bei RT.
<ol><li>Die zellulären Medien absaugen, Zellen auf Deckgläsern 3x in PBS waschen und Zellen in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min fixieren. PFA absaugen und Zellen in PBS 2x waschen. HINWEIS: Zellen können nun dehydriert und gelagert werden, wenn der Experimentator das Experiment zu einem anderen Zeitpunkt fortsetzen möchte. Fixierte Zellen können vor der Lagerung in EtOH dehydriert werden.<ol><li>Entfernen Sie PBS nach dem Waschen nach zellulärer Fixierung und ersetzen Sie es durch 500 μL 50% EtOH (v/v in Wasser). Inkubieren bei RT für 5 min.</li>
		<li>Entfernen Sie 50% EtOH und ersetzen Sie es durch 500 μL 70% EtOH. Inkubieren bei RT für 5 min.</li>
		<li>Entfernen Sie 70% EtOH und ersetzen Sie es durch 500 μL 100% EtOH. Inkubieren bei RT für 5 min.</li>
		<li>Entfernen Sie 100% EtOH und ersetzen Sie es durch frisches 100% EtOH. HINWEIS: Dehydrierte Zellen können bei -20 °C für 6 Monate gelagert werden. Versiegeln Sie die Platten vor der Lagerung mit Klebeband oder Parafilm, um das Verdampfen von EtOH zu verhindern.</li>
		<li>Rehydrieren Sie die Zellen, um zur multiplexten Fluoreszenzmarkierung von Zellen / Viren überzugehen.</li>
		<li>Entfernen Sie 100% EtOH und ersetzen Sie es durch 500 μL 70% EtOH. Inkubieren bei RT für 2 min. HINWEIS: Lassen Sie die Zellen zu keiner Zeit austrocknen. Verwenden Sie immer genügend Lösung, um alle Zellen einzutauchen.</li>
		<li>Entfernen Sie 70% EtOH und ersetzen Sie es durch 500 μL 50% EtOH. Inkubieren bei RT für 2 min.</li>
		<li>Entfernen Sie 50% EtOH und ersetzen Sie es durch 1x PBS. HINWEIS: Bereiten Sie Proteaseverdünnung, Hybridisierungssonden und Waschpuffer vor der Proteasebehandlung (Schritt 4) und der Zielsondenanwendung (Schritt 5) vor. Spezifische Anweisungen zur Reagenzienzubereitung finden Sie zu Beginn jedes jeweiligen Schritts.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagenzien</td>
			<td>Sonstige Anmerkungen</td>
		</tr><tr><td>Protease-Lösung</td>
			<td>Vorbereiten in 1X PBS</td>
		</tr><tr><td>Ziel-Oligonukletodie-Sonde(n)</td>
			<td>Verdünnung im Hybridisierungspuffer</td>
		</tr><tr><td>Waschpuffer</td>
			<td>Wascht nach Zielhybridisierungsschritten</td>
		</tr><tr><td>Hybridisierungspuffer</td>
			<td>Rezept in Tabelle 3</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Schlüsselreagenzien im MICDDRP-Protokoll.
3. Zellpermeabilisierung: Erhöht den Zugang in die Zelle und zellulären Organellen für den Eintritt großer Moleküle (Antikörper, Nukleinsäure-Hybridisierungssonden)
<ol><li>Entfernen Sie 1x PBS nach zellulärer Fixierung oder Rehydratation und ersetzen Sie es durch 500 μL 0,1% (v/v) Tween-20 in 1x PBS. Inkubieren bei RT für 10 min. Ersetzen Sie eins nach dem anderen. Einmal mit 500 μL 1x PBS waschen und frisches 1x PBS hinzufügen.</li>
</ol>4. Deckglasimmobilisierung auf Objektträger und Proteasebehandlung zur Entfernung von Nukleinsäure-bindenden Proteinen aus fixierter viraler/zellulärer Nukleinsäure zur Verbesserung der Hybridisierungseffizienz
HINWEIS: Bereiten Sie die verdünnte Protease III-Lösung (siehe Besonderheiten des Reagenzes in der Materialtabelle) während der zellulären Permeabilisierung vor. Lassen Sie die Protease vor der Permeabilisierung 10 Minuten lang RT erreichen.
<ol><li>Legen Sie einen kleinen Tropfen Nagellack auf einen sterilisierten Glasobjektträger. Trocknen Sie den Rücken (Seite ohne Zellschicht) und legen Sie den Rand des Deckglases auf den Nagellacktropfen, wobei die Seite mit den verklebten Zellen nach oben zeigt. Fügen Sie einige Tropfen PBS auf das immobilisierte Deckglas hinzu, um ein Austrocknen zu verhindern.<ol><li>Zeichnen Sie einen Kreis (ca. 3 mm vom Deckglas entfernt) um den Umfang des Deckglases, das jetzt mit einem hydrophoben Barrierestift (wasserabweisender Stift, der Reagenzien auf Zellen lokalisiert) auf dem Objektträger haftet.</li>
	</ol></li>
	<li>Verdünnte Protease III in 1x PBS (100 μL/Deckglas). HINWEIS: Die Proteasekonzentration muss möglicherweise in Abhängigkeit von Unterschieden in Zelltypen, Sonden oder Zielnukleinsäure(n) durch empirische Optimierung angepasst werden (siehe Diskussion). Für die effizienteste RNA/DNA-Markierung über verschiedene Virussysteme hinweg hatten wir Erfolg mit den folgenden Verdünnungen in Tabelle 2 unten mit Verdünnungen von (1 bis 2)-(1 bis 15) (Protease bis 1x PBS).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Sondenziele</td>
			<td>Proteaseverdünnung in 1X PBS (Protease III bis 1X PBS)</td>
		</tr><tr><td>HIV-1 DNA/RNA</td>
			<td>1 bis 5</td>
		</tr><tr><td>HTLV-1 DNA/RNA</td>
			<td>1 bis 5</td>
		</tr><tr><td>HBV-pgRNA und Gesamt-HBV-RNA</td>
			<td>1 bis 15</td>
		</tr><tr><td>IAV-RNA</td>
			<td>1 bis 15</td>
		</tr><tr><td>ZIKV-RNA</td>
			<td>1 bis 2</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Protease III-Verdünnungen in PBS für die virale Nukleinsäurehybridisierung.
<ol start="3"><li>Dekantieren Sie das 1x PBS nach der Immobilisierung auf dem Deckglas und tragen Sie die verdünnte Protease III auf.</li>
	<li>In einem befeuchteten Ofen bei 40 °C für 15 min inkubieren.</li>
	<li>Dekantieren Sie Proteaselösung und tauchen Sie Objektträger in 1x PBS. Mit einer Schaukelschale 2 min bei RT rühren. Wiederholen Sie das Waschen mit dem neuen 1x PBS.<ol><li>Für den DNA-Nachweis werden die Proben dreimal mit nukleasefreiem Wasser für jeweils 2 min gewaschen, gefolgt von einer Inkubation mit 5 mg/ml RNase A, verdünnt in PBS für 30 min bei 37 °C.</li>
		<li>Dekantieren Sie RNase A-Lösung und waschen Sie 3x für 2 min mit Reinstwasser. Fahren Sie mit ISH der Zielsonde(n) fort. HINWEIS: Hybridisierungspuffer verbessert die vDNA-Erkennung, ohne die vRNA-Färbeeffizienz für die vorgestellten Ergebnisse zu beeinträchtigen (repräsentative Ergebnisse). Verdünnte DNA Kanal 1 (C1) Sonden 1:1 mit Hybridisierungssonde. Verdünnte RNA C2- und C3-Sonden im Hybridisierungspuffer. Die in unseren bildgebenden Untersuchungen verwendeten C2- und C3-Sonden befinden sich in 50X-Lösungen (1:50; Zielsonde zu Hybridisierungspuffer).</li>
	</ol></li>
	<li>Bereiten Sie den Hybridisierungspuffer in nukleasefreiem Wasser nach dem folgenden Schritt-für-Schritt-Verfahren vor:<ol><li>In einem 15-ml-Röhrchen werden 700 μL Nuklease-freies Wasser, 300 μL 50% (Gewicht/Volumen (w/v)) Dextransulfat, 300 μL 5 M NaCl, 125 μL 200 mM Natriumcitrat (pH 6,2) und 375 mg (Pulver) Ethylencarbonat hinzugefügt.</li>
		<li>Mischen Sie gut mit einem Wirbel, um Ethylencarbonat aufzulösen (stellen Sie sicher, dass das gesamte Pulver gelöst und klar gelöst ist).</li>
		<li>Fügen Sie 25 μL von 10% (Volumen / Volumen (v / v)) Tween-20 und genügend nukleasefreies Wasser hinzu, um 2,5 ml (2x Lösung) zu vervollständigen. HINWEIS: Das Rezept für den Hybridisierungspuffer finden Sie in Tabelle 3 unten. Die Lösung ist für eine Woche stabil. Stellen Sie sicher, dass Tween-20-Reinigungsmittel ausreichend gemischt wird, und achten Sie darauf, ein Sprudeln der Lösung zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagenz</td>
			<td>Bestandskonzentration</td>
			<td>Zusätzliche Hinweise</td>
		</tr><tr><td>Nukleasefreies Wasser</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Dextransulfat</td>
			<td>50% (w/v)</td>
			<td>Sehr viskos</td>
		</tr><tr><td>Natriumchlorid</td>
			<td>5 M</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Natriumcitrat (pH 6,2)</td>
			<td>200 mM</td>
			<td>Bei 4 °C lagern</td>
		</tr><tr><td>Ethylencarbonat</td>
			<td>NA</td>
			<td>Pulver</td>
		</tr><tr><td>Tween-20</td>
			<td>10% (v/v)</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 3: Hybridisierungspufferliste der Reagenzien.
5. Inkubation mit DNA/RNA-Zielhybridisierungssonden: Ziel-Oligonukleotid-Sonden binden an interessierende Regionen und erzeugen ein molekulares Gerüst für Vorverstärker, Verstärker und Fluoreszenzsonden zum Binden.
HINWEIS: Warme DNA/RNA-Sonden bei 40 °C für 10 min (während der Zellpermeabilisierung) und kühlen für mindestens 10 min auf RT ab, wenn keine RNase-Behandlung enthalten ist. Wenn vor der Hybridisierung der Zielsonde eine RNase-Behandlung oder eine weitere Probenbehandlung erforderlich ist, werden die Sonden entsprechend warm. C2- und C3-Sonden nach dem Erwärmen herunterdrehen und im Hybridisierungspuffer verdünnen. Nach der Verdünnung können C2- und C3-Sonden kurz erwärmt werden. 50x Waschpuffer (siehe Materialtabelle ) bei 40 °C für 10-20 min erwärmen und auf 1x in molekularbiologischem Wasser verdünnen.
<ol><li>200 μL des Hybridisierungspuffers bei 67 °C für 10 min vor Zugabe der Hybridisierungssonde(n) inkubieren. Verdünnte Sonde im Hybridisierungspuffer (Rezept in Tabelle 2 aufgeführt). Fügen Sie 50 μL/Deckglas hinzu.</li>
	<li>Im befeuchteten Ofen bei 40 °C für 2 Stunden (h) inkubieren. Dekantsonden und Tauchschlitten in 1x Waschpuffer. Rühren, indem Sie die Schale für 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer.</li>
</ol>6. Verstärker (Amp) 1-FL Hybridisierung: Hinzufügen eines Vorverstärkers, der komplementär zur Schwanzsequenz der Ziel-DNA/RNA-Sonden ist (Schritt 5)
HINWEIS: Verstärker sollten vor dem Gebrauch auf RT sein. Holen Sie jeden einzelnen Verstärker 30 Minuten vor Gebrauch aus dem Kühlschrank und lassen Sie ihn bei RT auf der Bank.
<ol><li>Objektträger aus 1x Waschpuffer entfernen und klopfen/absorbieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 Tropfen Amp 1-FL auf das Deckglas hinzu. Im befeuchteten Ofen bei 40 °C 30 min inkubieren.</li>
	<li>Decant Amp 1-FL und 1x Waschpuffer eintauchen. Rühren, indem Sie die Schale 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer.</li>
</ol>7. Amp 2-FL Hybridisierung: Inkubation mit Signalverstärker mit verwandter Erkennungssequenz zu Vorverstärkern (Amp 1-FL)
<ol><li>Objektträger aus 1x Waschpuffer entfernen und klopfen/absorbieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 Tropfen Amp 2-FL auf das Deckglas hinzu. Im Befeuchtungsofen bei 40 °C 15 min inkubieren.</li>
	<li>Decant Amp 2-FL und 1x Waschpuffer eintauchen. Rühren, indem Sie die Schale 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer.</li>
</ol>8. Amp 3-FL Hybridisierung: Inkubation mit zweitem Signalverstärker
<ol><li>Objektträger aus 1x Waschpuffer entfernen und klopfen/absorbieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 Tropfen Amp 3-FL auf das Deckglas hinzu. Im befeuchteten Ofen bei 40 °C 30 min inkubieren.</li>
	<li>Decant Amp 3-FL und 1x Waschpuffer eintauchen. Rühren, indem Sie die Schale 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer.</li>
</ol>9. Amp 4-FL Hybridisierung: Fluoreszierende Markierung und letzter Hybridisierungsschritt
HINWEIS: In Tabelle 4 können Sie zunächst den geeigneten Amp 4 (A, B oder C)- FL basierend auf den Kanälen der Zielsonde(n) auswählen. Beurteilen Sie, welcher Amp 4-FL benötigt wird, um DNA / RNA von Interesse zu markieren. Ein Beispiel finden Sie in der folgenden Tabelle:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>Ein</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td>DNA-Kanal 1 (C1)</td>
			<td>488</td>
			<td>550</td>
			<td>550</td>
		</tr><tr><td>DNA/RNA Kanal 2 (C2)</td>
			<td>550</td>
			<td>488</td>
			<td>647</td>
		</tr><tr><td>RNA-Kanal 3 (C3)</td>
			<td>647</td>
			<td>647</td>
			<td>488</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 4: Auswahl der Amp 4 (A, B oder C)-FL Fluoreszenzsonde für gemultiplexte ISH.
HINWEIS: Für gemultiplexte FISH (mehrere Ziele) ist die Auswahl des richtigen Amp 4 (A, B oder C)- FL entscheidend für die korrekte Kennzeichnung Ihres Ziels von Interesse. Zielsonden (Schritt 5) haben unterschiedliche Farbkanäle (C1, C2 oder C3), die ihre jeweilige fluoreszierende Markierung (Alexa 488, Atto 550 oder Alexa 647) bestimmen, basierend auf dem gewählten Amp 4-FL. Beispiele für die Auswahl von Fluorophorkombinationen für die Multiplexbildgebung finden Sie in den Legenden von Abbildung 2 und Abbildung 3. Als weiteres Beispiel wird die Auswahl von Amp 4B-FL selektiv DNA-C1-Sonden mit Atto 550 und RNA-C3-Sonden mit Alexa 647 markieren.
<ol><li>Objektträger aus 1x Waschpuffer entfernen und klopfen/absorbieren, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.</li>
	<li>Fügen Sie 1 Tropfen Amp 4-FL auf das Deckglas hinzu. Im Befeuchtungsofen bei 40 °C 15 min inkubieren. HINWEIS: Bewahren Sie nach Schritt 9.2 die Proben bedeckt und vor Licht geschützt auf.</li>
	<li>Decant Amp 4-FL und 1x Waschpuffer eintauchen. Rühren, indem Sie die Schale für 2 min bei RT schaukeln. Wiederholen Sie die Wäsche mit dem neuen 1x Waschpuffer. Mit 1x PBS waschen (2 min) und in PBS lagern.</li>
</ol>10. Proteinimmunfärbung: Zur Markierung von Protein(en) von Interesse
<ol><li>Dekantieren Sie PBS und geben Sie 200 μL Blockierpuffer (1% w/v BSA, 10% v/v FBS in PBS mit 0,1% v/v Tween-20 (PBST)) zum Deckglas. Inkubation 1 h bei RT.</li>
	<li>Dekant blockierenden Puffer und 200 μL primären Antikörper verdünnt in PBST + 1% w/v BSA auftragen. Inkubation 1 h bei RT.</li>
	<li>Waschen Sie den Objektträger zweimal mit PBST für 10 min bei RT mit Schütteln.</li>
	<li>Wenden Sie sekundäre Antikörper Ihrer Wahl für 1 h bei RT in PBST + 1% w/v BSA an.</li>
	<li>Waschen Sie den Objektträger mit PBST für 10 min bei RT mit Schütteln.</li>
</ol>11. Kernfärbung: Gegenfärbungskerne nach Immunfärbung
<ol><li>Dekantieren Sie PBST und tragen Sie DAPI oder Kernfärbung Ihrer Wahl für 1 min bei RT auf.</li>
	<li>Waschen Sie den Objektträger zweimal mit PBS für 10 min bei RT mit Schütteln.</li>
</ol>12. Montage
<ol><li>Geben Sie 1 Tropfen Antifade-Lösung (z. B. Prolong Gold) auf den neuen sterilen Objektträger (zuerst den Objektträger mit EtOH reinigen und trocknen lassen, um sicherzustellen, dass sich keine Rückstände auf dem Glas befinden). Verteilen Sie mit derselben Spitze den Antifade-Lösungstropfen, um einen Bereich von der Größe des Deckglases zu bedecken. HINWEIS: Die Antifade-Lösung ist sehr viskos und kann schwierig zu pipetten sein. Das Abschneiden der Spitze einer 200-μL-Spitze vor dem Pipettieren kann diese Probleme mildern.</li>
	<li>Entfernen Sie Deckglas mit Zellprobe vom Objektträger und tauchen Sie in PBS ein, um den restlichen Nagellack auf der Rückseite mit der Pinzette und PBS zu entfernen. Trocknen Sie die Pinzette und die Rückseite des Deckglases mit einem Kimwipe.</li>
	<li>Deckglas vorsichtig in den Tropfen der Antifade-Lösung einbetten und Probenseite (Seite mit Zellschicht) des Deckglases auf Tropfen legen).</li>
	<li>Proben über Nacht trocknen lassen.</li>
</ol>13. Bildgebung
<ol><li>Bild mit einem Epifluoreszenzmikroskop.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zheng, Q., Lavis, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+photostable+fluorophores+for+molecular+imaging.">Development of photostable fluorophores for molecular imaging.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 39, 32-38 (2017).</li><li>Marini, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+architecture+dictates+HIV-1+integration+site+selection.">Nuclear architecture dictates HIV-1 integration site selection.</a> Nature. 521 (7551), 227-231 (2015).</li><li>Puray-Chavez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+single-cell+visualization+of+nucleic+acids+and+protein+during+HIV+infection.">Multiplex single-cell visualization of nucleic acids and protein during HIV infection.</a> Nature Communications. 8 (1), 1882 (2017).</li><li>Ukah, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+HIV-1+RNA+Transcription+from+Integrated+HIV-1+DNA+in+Reactivated+Latently+Infected+Cells.">Visualization of HIV-1 RNA Transcription from Integrated HIV-1 DNA in Reactivated Latently Infected Cells.</a> Viruses. 10 (10), (2018).</li><li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+Positive+and+Negative+Sense+Viral+RNA+for+Probing+the+Mechanism+of+Direct-Acting+Antivirals+against+Hepatitis+C+Virus.">Visualization of Positive and Negative Sense Viral RNA for Probing the Mechanism of Direct-Acting Antivirals against Hepatitis C Virus.</a> Viruses. 11 (11), (2019).</li><li>Achuthan, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capsid-CPSF6+Interaction+Licenses+Nuclear+HIV-1+Trafficking+to+Sites+of+Viral+DNA+Integration.">Capsid-CPSF6 Interaction Licenses Nuclear HIV-1 Trafficking to Sites of Viral DNA Integration.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (3), 392-404 (2018).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+detection+of+RNA+using+MERFISH+and+branched+DNA+amplification.">Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification.</a> Scientific Reports. 9 (1), 7721 (2019).</li><li>Player, A. N., Shen, L. P., Kenny, D., Antao, V. P., Kolberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-copy+gene+detection+using+branched+DNA+(bDNA)+in+situ+hybridization.">Single-copy gene detection using branched DNA (bDNA) in situ hybridization.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 49 (5), 603-612 (2001).</li><li>Battich, N., Stoeger, T., Pelkmans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image-based+transcriptomics+in+thousands+of+single+human+cells+at+single-molecule+resolution.">Image-based transcriptomics in thousands of single human cells at single-molecule resolution.</a> Nature Methods. 10 (11), 1127-1133 (2013).</li><li>Bushnell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ProbeDesigner:+for+the+design+of+probesets+for+branched+DNA+(bDNA)+signal+amplification+assays.">ProbeDesigner: for the design of probesets for branched DNA (bDNA) signal amplification assays.</a> Bioinformatics. 15 (5), 348-355 (1999).</li><li>Stultz, R. D., Cenker, J. J., McDonald, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+HIV-1+Genomic+DNA+from+Entry+through+Productive+Infection.">Imaging HIV-1 Genomic DNA from Entry through Productive Infection.</a> Journal of Virology. 91 (9), (2017).</li><li>Brown, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+nuclear+proteins+together+with+transcribed+and+inactive+genes+in+structurally+preserved+cells.">Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells.</a> Methods. 26 (1), 10-18 (2002).</li><li>Francis, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+replication+complexes+accumulate+in+nuclear+speckles+and+integrate+into+speckle-associated+genomic+domains.">HIV-1 replication complexes accumulate in nuclear speckles and integrate into speckle-associated genomic domains.</a> Nature Communications. 11 (1), 3505 (2020).</li><li>Dharan, A., Bachmann, N., Talley, S., Zwikelmaier, V., Campbell, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+pore+blockade+reveals+that+HIV-1+completes+reverse+transcription+and+uncoating+in+the+nucleus.">Nuclear pore blockade reveals that HIV-1 completes reverse transcription and uncoating in the nucleus.</a> Nature Microbiology. 5 (9), 1088-1095 (2020).</li></ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die gleichzeitige Visualisierung von RNA, DNA und Protein erfordert oft umfangreiche Optimierungen. Zwei häufig verwendete Methoden sind die 5-Ethinyl-2-Desoxyuridin-Markierung (EdU) und die DNA-FISH. Die EdU-Markierung wurde angewendet, um virale DNA und Protein gleichzeitig sichtbar zu machen, da EdU in naszierende DNA eingebaut und anschließend mit azidhaltigen Fluoreszenzfarbstoffen über Klickchemie markiert wird. Die EdU-Markierung kann somit verwendet werden, um die native Virusreplikationskinetik von D...

Während Tausende von kommerziellen Antikörpern verfügbar sind, um Proteine über konventionelle Immunfärbungsansätze spezifisch zu markieren, und während Fusionsproteine mit photooptimierten fluoreszierenden Tags zur Verfolgung mehrerer Proteine in einer Probe hergestellt werden können1, ist die mikroskopische Visualisierung von Proteinen oft nicht kompatibel mit der herkömmlichen DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH)2 . Technische Einschränkungen bei der gleichzeitigen Visualisierung von DNA, RNA und Protein mit fluoreszenzbasierten Ansätzen haben ein tiefes Verständnis der Virusreplikation behindert. Die Verfolgung von viraler Nukleinsäure und Protein während der Infektion ermöglicht es Virologen, grundlegende Prozesse zu visualisieren, die der Replikation und Assemblierung von Viren zugrunde liegen 3,4,5,6.
Wir haben einen bildgebenden Ansatz entwickelt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and Protein (MICDDRP)3, der verzweigte DNA (bDNA) in situ Technologie verwendet, um die Empfindlichkeit der Nukleinsäuredetektion zu verbessern 7,8,9 . Darüber hinaus verwendet diese Methode gepaarte Sonden für eine verbesserte Spezifität. bDNA-sequenzspezifische Sonden verwenden verzweigte Vorverstärker- und Verstärker-DNAs, um ein intensives und lokalisiertes Signal zu erzeugen und frühere Hybridisierungsmethoden zu verbessern, die auf wiederholten Regionen in der DNA beruhten9. Infizierte Zellen in einem klinischen Kontext enthalten oft kein reichlich vorhandenes virales genetisches Material, was eine Ware für eine empfindliche Methode zum Nachweis fluoreszierender Nukleinsäure in diagnostischen Umgebungen darstellt. Die Kommerzialisierung der bDNA-Technologie durch Ansätze wie RNAscope7 und ViewRNA10 hat diese Nische gefüllt. Die Empfindlichkeit der bDNA-Fluoreszenzbildgebung hat auch einen wichtigen Nutzen in der Zellbiologie, da sie den Nachweis seltener Nukleinsäurespezies in Zellkulturmodellen ermöglicht. Die enorme Verbesserung der Empfindlichkeit macht bDNA-basierte Bildgebungsverfahren für die Untersuchung von Viren geeignet. Ein mögliches Manko ist jedoch, dass sich diese Methoden auf die Visualisierung von RNA oder RNA und Protein konzentrieren. Alle replizierenden Zellen und viele Viren haben DNA-Genome oder bilden während ihres Replikationszyklus DNA, was Methoden, die sowohl RNA und DNA als auch Protein abbilden können, sehr wünschenswert macht.
Im MICDDRP-Protokoll führen wir bDNA-FISH zum Nachweis viraler Nukleinsäure mit der RNAscope-Methode mit Modifikationen7 durch. Eine der wichtigsten Änderungen an diesem Protokoll ist die Optimierung der Proteasebehandlung nach chemischer Fixierung. Die Proteasebehandlung erleichtert die Entfernung von Proteinen, die an Nukleinsäure gebunden sind, um die Effizienz der Sondenhybridisierung zu verbessern. Auf die Proteasebehandlung folgt die Inkubation mit verzweigten Oligonukleotidsonden. Nach dem Auftragen der bDNA-Sonde(n) werden die Proben gewaschen und anschließend mit Signalvorverstärker- und Verstärker-DNAs inkubiert. Die multiplexierte In-situ-Hybridisierung (ISH), die Markierung mehrerer Gentargets, erfordert Zielsonden mit unterschiedlichen Farbkanälen für die spektrale Differenzierung7. Auf die Inkubation mit DNA-Verstärkern folgt die Immunfluoreszenz (IF).
bDNA ISH bewirkt Verbesserungen des Signal-Rauschens durch Verstärkung zielspezifischer Signale, mit einer Reduktion des Hintergrundrauschens von unspezifischen Hybridisierungsereignissen 7,11. Zielsonden werden unter Verwendung öffentlich zugänglicher Softwareprogramme entworfen, die die Wahrscheinlichkeit unspezifischer Hybridisierungsereignisse vorhersagen und die Schmelztemperatur (Tm) des Sonden-Ziel-Hybrids 7,11 berechnen. Zielsonden enthalten eine 18- bis 25-Basen-Region, die komplementär zur Ziel-DNA/RNA-Sequenz ist, eine Spacer-Sequenz und eine 14-Basen-Schwanzsequenz. Ein Paar Zielsonden, jede mit einer bestimmten Schwanzsequenz, hybridisiert zu einer Zielregion (über ~ 50 Basen). Die beiden Schwanzsequenzen bilden eine Hybridisierungsstelle für die Vorverstärkersonden, die 20 Bindungsstellen für die Verstärkersonden enthalten, die zusätzlich 20 Bindungsstellen für die Markierungssonde enthalten. Zum Beispiel wird eine Region von einer Kilobase (kb) auf dem Nukleinsäuremolekül von 20 Sondenpaaren anvisiert, wodurch ein molekulares Gerüst für die sequentielle Hybridisierung mit dem Vorverstärker, dem Verstärker und der Markierungssonde entsteht. Dies kann somit zu einer theoretischen Ausbeute von 8000 fluoreszierenden Markierungen pro Nukleinsäuremolekül führen, was den Nachweis einzelner Moleküle und enorme Verbesserungen gegenüber herkömmlichen FISH-Ansätzen ermöglicht7 (siehe Abbildung 1A für eine schematische Darstellung der bDNA-Signalamplifikation). Um Sonden für gemultiplextes ISH einzurichten, muss sich jede Zielsonde in einem anderen Farbkanal befinden (C1, C2 oder C3). Diese Zielsonden mit unterschiedlichen Farbkanälen besitzen unterschiedliche 14-Basen-Schwanzsequenzen. Diese Schwanzsequenzen binden unterschiedliche Signalverstärker mit verschiedenen Fluoreszenzsonden und ermöglichen so eine einfache spektrale Differenzierung über mehrere Ziele hinweg. Im vorgestellten Protokoll enthält Tabelle 4 in Schritt 9 weitere Informationen zu fluoreszenzmarkierenden Zielsonden. Darüber hinaus zeigen Abbildung 2 und Abbildung 3 Beispiele, wie wir den geeigneten Verstärker 4-FL (A, B oder C) (Fluoreszenzsonde und den letzten Hybridisierungsschritt) ausgewählt haben, um eine spezifische fluoreszierende Markierung mehrerer viraler Nukleinsäureziele nach HIV-1- und HTLV-1-Infektionen zu erreichen.
Wir haben mehrere Anwendungen der simultanen Fluoreszenzvisualisierung von RNA, DNA und Proteinen demonstriert und kritische Stadien der Virusreplikation mit hoher raumzeitlicher Auflösung 3,4,5 beobachtet. Zum Beispiel hat uns die gleichzeitige Einzelzellvisualisierung von viraler RNA, zytoplasmatischer und nukleärer DNA und Proteinen ermöglicht, Schlüsselereignisse während der HIV-1-Infektion zu visualisieren, einschließlich der Verfolgung von RNA-haltigen Kernen im Zytoplasma vor dem Kerneintritt und der Integration von proviraler DNA3. Darüber hinaus haben wir MICDDRP angewendet, um die Auswirkungen von Wirtsfaktoren und medikamentöser Behandlung auf Virusinfektionen und Replikation zu charakterisieren 4,5. In Ukah et al. verfolgten wir die Reaktivierung der HIV-1-Transkription in Latenzzellmodellen, die mit verschiedenen Latenzumkehrern behandelt wurden, um die HIV-Transkription und die Latenzumkehrung 4 zu visualisieren. Darüber hinaus kann MICDDRP es uns ermöglichen, phänotypische Veränderungen im Zusammenhang mit antiviraler Hemmung zu visualisieren, die auf die Behandlung kleiner Moleküle oder die Einschränkung des Wirtsfaktors zurückzuführen sind. Als Proof of Concept für die Robustheit und breite Anwendbarkeit unseres Ansatzes haben wir gezeigt, dass wir Modifikationen unseres Protokolls verwenden können, um virale Nukleinsäure effizient zu markieren, um Infektionen nicht nur im humanen Immundefizienzvirus (HIV)-1, sondern auch im humanen T-lymphotropen Virus (HTLV)-1, Hepatitis-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus (HCV), Zika-Virus (ZIKV) und Influenza-A-Virus (IAV). Da der HIV-1-Lebenszyklus sowohl aus viraler DNA als auch aus RNA-Spezies besteht, haben wir den Großteil unserer Optimierung von MICDDRP nach HIV-1-Replikationskinetik durchgeführt. Darüber hinaus haben wir jedoch gezeigt, dass wir die Synthese verschiedener viraler RNA-Transkripte von einem oder beiden Sense- (+) und Antisense- (-) Strängen in Viren wie ZIKV, IAV, HBV und HCV verfolgen können, um die virale Transkription und Replikation zu überwachen 3,4,5,6. Die Studien zielen darauf ab, das mechanistische Verständnis mehrerer viraler Prozesse zu verbessern und dienen als Richtlinie für die Implementierung dieser Fluoreszenzbildgebungstechnologie auf ein breites Spektrum von Zellmodellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>4% PFA</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% dextran sulfate</td>
			<td>Amreso</td>
			<td>198</td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50X wash buffer</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>320058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 1-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 2-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 3-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amplifier 4-FL</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td>Consult Amp-4 table in protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HCV NS5a antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab13833</td>
			<td>Mouse monoclonal; works with HCV genotypes 1a, 1b, 3, and 4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-HIV-1 p24 monoclonal antibody</td>
			<td>NIH AIDS Reagent Program</td>
			<td>3537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Mov10 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab80613</td>
			<td>Rabbit polyclonal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PB1 antibody</td>
			<td>GeneTex</td>
			<td>GTX125923</td>
			<td>Antibody against flu protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Blocking reagent for immunostaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell media with supplements</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Media appropriate for cell model</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td></td>
			<td>Nuclear stain (RNAscope kit from ACD Bio)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate buffered saline (1X PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190250</td>
			<td>No calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene carbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E26258</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use specific FBS based on what serum secondary antibody was raised in (e.g goat FBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand colorfrost plus microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-17/18/19</td>
			<td>Precleaned</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCV-GT2a-sense-C2 probe</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441371</td>
			<td>HCV(+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-gagpol-C1</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>317701</td>
			<td>HIV-1 cDNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIV-nongagpol-C3</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>317711-C</td>
			<td>HIV-1 RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ hybridization oven</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>321710/321720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImmEdge hydrophobic barrier pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For immobolizing coverslip to slide prior to protease treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-d-lysine (PDL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Coat coverslips in 20 &#181;g/mL of PDL for 30 minutes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probe diluent</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>300041</td>
			<td>For diluting RNA C2 or C3 probes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong gold antifade</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>P36930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease III</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>322337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope&#174;&#160;Probe- V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>436221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium citrate, pH 6.2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For DNA hybridization buffer and PBS-T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HBV-GTD</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441351</td>
			<td>Total HBV RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HBV-GTD-01-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>465531-C2</td>
			<td>HBV pgRNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HCV-GT2a probe</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>441361</td>
			<td>HCV(-) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV-HBZ-sense-C3</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495071-C3</td>
			<td>HTLV-1 (-) sense RNA probe targetting HBZ</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV1-GAG-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495051-C2</td>
			<td>HTLV-1 DNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-HTLV1-GAG-POL-sense</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>495061</td>
			<td>HTLV-1 (+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-Influenza-H1N1-H5N1-NP</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>436221</td>
			<td>IAV RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-ZIKA-pp-O2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>464531</td>
			<td>Zika(+) sense RNA probe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V-ZIKA-pp-O2-sense-C2</td>
			<td>ACD Bio</td>
			<td>478731-C2</td>
			<td>Zika(-) sense RNA probe</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single-cell multiplexed fluorescence imaging to visualize viral nucleic acids and proteins and monitor hiv, htlv, hbv, hcv, zika virus, and influenza infection

Die Erfassung der dynamischen Replikations- und Assemblierungsprozesse von Viren wurde durch den Mangel an robusten In-situ-Hybridisierungstechnologien (ISH) behindert, die eine empfindliche und gleichzeitige Markierung von viraler Nukleinsäure und -protein ermöglichen. Herkömmliche Methoden der DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) sind oft nicht mit der Immunfärbung kompatibel. Wir haben daher einen bildgebenden Ansatz entwickelt, MICDDRP (multiplex immunofluorescent cell-based detection of D NA, RNA and protein), der die gleichzeitige Einzelzellvisualisierung von DNA, RNA und Protein ermöglicht. Im Vergleich zu herkömmlichen DNA-Fischen verwendet micddrp die verzweigte DNA (bDNA) ISH-Technologie, die die Empfindlichkeit und Detektion von Oligonukleotidsonden drastisch verbessert. Kleine Modifikationen von MICDDRP ermöglichen die Abbildung viraler Proteine gleichzeitig mit Nukleinsäuren (RNA oder DNA) unterschiedlicher Litze. Wir haben diese Protokolle angewendet, um die Lebenszyklen mehrerer viraler Krankheitserreger zu untersuchen, darunter das humane Immundefizienzvirus (HIV)-1, das humane T-lymphotrope Virus (HTLV)-1, das Hepatitis-B-Virus (HBV), das Hepatitis-C-Virus (HCV), das Zika-Virus (ZKV) und das Influenza-A-Virus (IAV). Wir haben gezeigt, dass wir virale Nukleinsäuren und Proteine über eine Vielzahl von Viren hinweg effizient markieren können. Diese Studien können uns ein verbessertes mechanistisches Verständnis mehrerer viraler Systeme liefern und dienen darüber hinaus als Vorlage für die Anwendung der Multiplex-Fluoreszenzbildgebung von DNA, RNA und Protein in einem breiten Spektrum zellulärer Systeme.

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung von MICDDRP. Auf die Markierung von DNA und RNA folgt die Immunfärbung. Die Verwendung von Verzweigungsverstärkern erhöht das Signal und ermöglicht den Nachweis einzelner Nukleinsäuremoleküle.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61843/61843fig1v5.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung von MICDDRP und Schritt-für-Schritt-Workflow....

Watch this Scientific Journal Video about Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infectio

Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz kann auf eine Vielzahl von Systemen angewendet werden.

Einzelzell-Multiplex-Fluoreszenzbildgebung zur Visualisierung viraler Nukleinsäuren und Proteine und zur Überwachung von HIV-, HTLV-, HBV-, HCV-, Zika-Virus- und Influenza-Infektionen

Capturing the dynamic replication and assembly processes of viruses has been hindered by the lack of robust in situ hybridization (ISH) technologies that ...

single-cell-multiplexed-fluorescence-imaging-to-visualize-viral

Research

JoVE Journal

Biology

2.7K Aufrufe.  Emory University School of Medicine. Hier wird ein Protokoll für einen Fluoreszenzbildgebungsansatz vorgestellt, multiplex immunofluorescent cell-based detection of DNA, RNA, and protein (MICDDRP), eine Methode, die in der Lage ist, gleichzeitig Fluoreszenz-Einzelzellvisualisierung von viralen Proteinen und Nukleinsäuren unterschiedlicher Art und Strandung zu visualisieren. Dieser Ansatz k...

Serie: Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Forschung

Biologie

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in determining outcomes that range from clearance to chronic persistent infections. We describe here a method for assessing the spatial and quantitative relationships between immune effector (E) virus-specific CD8+ T cells and infected targets (T) that combines in situ tetramer (IST) staining to detect virus-specific CD8+ T cells and in situ hybridization (ISH) to detect viral-RNA+ cells in the tissues where the battle between immune defenses and infection takes place. The combination of IST staining and ISH, abbreviated ISTH, enables visualization and mapping of the locations of immune effector cells and targets, and facile determination of E:T ratios.  These parameters in turn can then be used to determine the relationships between spatial proximity, and the timing and magnitude of the immune response that predict outcomes in early infection.

A Technique to Simultaneously Visualize Virus-Specific CD8+ T Cells and Virus-Infected Cells In situ

A technique combining in situ tetramer staining and in situ hybridization (ISTH) enables visualization, mapping and analysis of the spatial proximity of virus-specific CD8+ T cells to their virus-infected targets, and determination of the quantitative relationships between these immune effectors and targets to infection outcomes.

Eine Technik, um gleichzeitig zu visualisieren Virus-spezifische CD8 + T-Zellen und Virus-infizierten Zellen In situ</em

The numbers and locations of virus-specific CD8+ T cells relative to the numbers and locations of their infected cell targets is thought to be critical in ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren und Proteinen Mit dem Micro-Volumen Bio-spec Nano-Spektralphotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Chemically-blocked Antibody Microarray for Multiplexed High-throughput Profiling of Specific Protein Glycosylation in Complex Samples

In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that allows for the glycosylation profiling of specific proteins. Glycosylation of proteins is the most prevalent post-translational modification found on proteins, and leads diversified modifications of the physical, chemical, and biological properties of proteins. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases. However, current methods to study protein glycosylation typically are too complicated or expensive for use in most normal laboratory or clinical settings and a more practical method to study protein glycosylation is needed. The new protocol described in this study makes use of a chemically blocked antibody microarray with glycan-binding protein (GBP) detection and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements needed to study protein glycosylation. In this method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies are printed directly onto the microarray slides and the N-glycans on the antibodies are blocked. The blocked, immobilized glycoprotein-specific antibodies are able to capture and isolate glycoproteins from a complex sample that is applied directly onto the microarray slides. Glycan detection then can be performed by the application of biotinylated lectins and other GBPs to the microarray slide, while binding levels can be determined using Dylight 549-Streptavidin. Through the use of an antibody panel and probing with multiple biotinylated lectins, this method allows for an effective glycosylation profile of the different proteins found in a given human or animal sample to be developed.
Introduction
Glycosylation of protein, which is the most ubiquitous post-translational modification on proteins, modifies the physical, chemical, and biological properties of a protein, and plays a fundamental role in various biological processes1-6. Because the glycosylation machinery is particularly susceptible to disease progression and malignant transformation, aberrant glycosylation has been recognized as early detection biomarkers for cancer and other diseases 7-12. In fact, most current cancer biomarkers, such as the L3 fraction of &alpha;-1 fetoprotein (AFP) for hepatocellular carcinoma 13-15, and CA199 for pancreatic cancer 16, 17 are all aberrant glycan moieties on glycoproteins. However, methods to study protein glycosylation have been complicated, and not suitable for routine laboratory and clinical settings. Chen et al. has recently invented a chemically blocked antibody microarray with a glycan-binding protein (GBP) detection method for high-throughput and multiplexed profile glycosylation of native glycoproteins in a complex sample 18. In this affinity based microarray method, multiple immobilized glycoprotein-specific antibodies capture and isolate glycoproteins from the complex mixture directly on the microarray slide, and the glycans on each individual captured protein are measured by GBPs. Because all normal antibodies contain N-glycans which could be recognized by most GBPs, the critical step of this method is to chemically block the glycans on the antibodies from binding to GBP. In the procedure, the cis-diol groups of the glycans on the antibodies were first oxidized to aldehyde groups by using NaIO4 in sodium acetate buffer avoiding light. The aldehyde groups were then conjugated to the hydrazide group of a cross-linker, 4-(4-N-MaleimidoPhenyl)butyric acid Hydrazide HCl (MPBH), followed by the conjugation of a dipeptide, Cys-Gly, to the maleimide group of the MPBH. Thus, the cis-diol groups on glycans of antibodies were converted into bulky none hydroxyl groups, which hindered the lectins and other GBPs bindings to the capture antibodies. This blocking procedure makes the GBPs and lectins bind only to the glycans of captured proteins. After this chemically blocking, serum samples were incubated with the antibody microarray, followed by the glycans detection by using different biotinylated lectins and GBPs, and visualized with Cy3-streptavidin. The parallel use of an antibody panel and multiple lectin probing provides discrete glycosylation profiles of multiple proteins in a given sample 18-20. This method has been used successfully in multiple different labs 1, 7, 13, 19-31. However, stability of MPBH and Cys-Gly, complicated and extended procedure in this method affect the reproducibility, effectiveness and efficiency of the method. In this new protocol, we replaced both MPBH and Cys-Gly with one much more stable reagent glutamic acid hydrazide (Glu-hydrazide), which significantly improved the reproducibility of the method, simplified and shorten the whole procedure so that the it can be completed within one working day. In this new protocol, we describe the detailed procedure of the protocol which can be readily adopted by normal labs for routine protein glycosylation study and techniques which are necessary to obtain reproducible and repeatable results.

In this study, we describe an improved protocol for a multiplexed high-throughput antibody microarray with lectin detection method that can be used in glycosylation profiling of specific proteins. This protocol features new reliable reagents and significantly reduces the time, cost, and lab equipment requirements as compared to the previous procedure.

Chemisch-Antikörper blockiert Microarray für Multiplex-High-Throughput-Profiling von spezifischen Protein-Glykosylierung bei Complex Samples

 In this study, we describe an effective protocol for use in a multiplexed high-throughput antibody microarray with glycan binding protein detection that ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Sequenzspezifische Markierung von Nukleinsäuren und Proteinen mit Methyltransferasen und Cofaktor-Analoga

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Functional Imaging of Viral Transcription Factories Using 3D Fluorescence Microscopy

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to understand where and when transcription is taking place within nuclear space and to visualize the relationship between episomes infected within the same cell's nucleus. Here, both immunofluorescence (IFA) and RNA-FISH have been combinedto identify actively transcribing Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) episomes. By staining KSHV latency-associated nuclear antigen (LANA), it is possible to locate where viral episomes exist within the nucleus. In addition, by designing RNA-FISH probes to target the intron region of a viral gene, which is expressed only during productive infection, nascent RNA transcripts can be located. Using this combination of molecular probes, it is possible to visualize the assembly of large viral transcription factories and analyze the spatial regulation of viral gene expression during KSHV reactivation. By including anti-RNA polymerase II antibody staining, one can also visualize the association between RNA polymerase II (RNAPII) aggregation and KSHV transcription during reactivation.

Viral transcriptional factories are discrete structures that are enriched with cellular RNA polymerase II to increase viral gene transcription during reactivation. Here, a method to locate sites of actively transcribing viral chromatin in 3D nuclear space by a combination of immunofluorescence staining and in situ RNA hybridization is described.

Funktionelle Bildgebung der virale Transkription Fabriken mit 3D Fluoreszenz-Mikroskopie

It is well known that spatial and temporal regulation of genes is an integral part of governing proper gene expression. Consequently, it is invaluable to ...

Single Cell Micro-aspiration as an Alternative Strategy to Fluorescence-activated Cell Sorting for Giant Virus Mixture Separation

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or fluorescence activated cell sorting (FACS) applied to the viral population. However, when the viruses in the mixture have similar morphologic properties and one of the viruses multiplies slowly, the presence of two viruses is discovered at the stage of genome assembly and the viruses cannot be separated for further characterization. To solve this problem, we developed a single cell micro-aspiration procedure that allows for separation and cloning of highly similar viruses. In the present work, we present how this alternative strategy allowed us to separate the small viral subpopulations of Clandestinovirus ST1 and Usurpativirus LCD7, giant viruses that grow slowly and do not lead to amoebal lysis compared to the lytic and fast-growing Faustovirus. Purity control was assessed by specific gene amplification and viruses were produced for further characterization.

Here, we describe a single cell micro-aspiration method for the separation of infected amoebae. In order to separate viral subpopulations in Vermamoeba vermiformis infected by Faustoviruses and unknown giant viruses, we developed the protocol detailed below and demonstrated its ability to separate two low-abundance novel giant viruses.

Single Cell Micro-Aspiration als Alternative zur fluoreszenzaktivierten Zellsortierung für die Trennung von Riesenviren

During the amoeba co-culture process, more than one virus may be isolated in a single well. We previously solved this issue by end point dilution and/or ...

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as epitranscriptomics. Among others, N6-methyladenosine (m6A) and 5-methylcytosine (m5C) RNA modifications have been described on mRNA molecules and may have a role in modulating cellular processes. Epitranscriptomics is thus a new layer of regulation that must be considered in addition to transcriptomic analyses, as it can also be altered or modulated by exposure to any chemical or biological agent, including viral infections.
Here, we present a workflow that allows analysis of the joint cellular and viral epitranscriptomic landscape of the m6A and m5C marks simultaneously, in cells infected or not with the human immunodeficiency virus (HIV). Upon mRNA isolation and fragmentation from HIV- infected and non-infected cells, we used two different procedures: MeRIP-Seq, an RNA immunoprecipitation-based technique, to enrich for RNA fragments containing the m6A mark and BS-Seq, a bisulfite conversion-based technique, to identify the m5C mark at a single nucleotide resolution. Upon methylation-specific capture, RNA libraries are prepared for high-throughput sequencing. We also developed a dedicated bioinformatics pipeline to identify differentially methylated (DM) transcripts independently from their basal expression profile.
Overall, the methodology allows exploration of multiple epitranscriptomic marks simultaneously and provides an atlas of DM transcripts upon viral infection or any other cell perturbation. This approach offers new opportunities to identify novel players and novel mechanisms of cell response, such as cellular factors promoting or restricting viral replication.

Exploring m6A and m5C Epitranscriptomes upon Viral Infection: an Example with HIV

The role of RNA modifications in viral infections is just starting to be explored and could highlight new viral-host interaction mechanisms. In this work, we provide a pipeline to investigate m6A and m5C RNA modifications in the context of viral infections.

Erforschung von m6A- und m5C-Epitranskriptomen bei Virusinfektion: ein Beispiel mit HIV

The role of RNA modifications in biological processes has been the focus of an increasing number of studies in the last few years and is known nowadays as ...