Name: sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis
Uploaded: 2020-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis at JoVE.com

Los autores agradecen a Vanessa Meldener-Harrell por la lectura crítica del manuscrito.

El uso de ratones como fuente de sangre para la alimentación de moscas de arena se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del NIAID, NIH (número de protocolo LPD 68E). Los invertebrados no están cubiertos por las directrices de los NIH.
1. Preparación de la aguja (Figura 1)
<ol><li>Tire de agujas y bisel como se describe en Meuti y Harrell19. Brevemente, tire de agujas en un extractor de micropipette de vidrio de doble etapa, utilizando capilares de vidrio borosilicato.</li>
	<li>Afilar las agujas al biselar húmedo en el biselador de micropipette, utilizando una piedra extra fina.</li>
</ol>2. Colección de embriones y micromanipulación (Figura 2)
<ol><li>Cinco días antes del día de la inyección, las hembras de arena de ensangrendero se realizan rutinariamente para el mantenimiento de colonias. Para obtener más información sobre los procedimientos de cría de colonias de moscas de arena y el material requerido, consulte Abogado et al.1 Mantenga los insectos en incubadoras al 70% de humedad y a 26 °C, durante todo su desarrollo.<ol>
<li>Un día después de la alimentación en la sangre, capturar hembras alimentadas con sangre por grupos de 100-150 en macetas de yeso con un puerto lateral. Mantener a las hembras alimentándolas con solución de azúcar (30% sacarosa – suficiente volumen para remojar una pequeña bola de algodón) que es habitual para el mantenimiento de colonias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En el día 2-3 después de la alimentación en la sangre, NO humedezca las ollas de yeso. Mantener a las hembras en un sustrato seco evitará la puesta prematura de huevos, ya que las hembras prefieren poner huevos en un ambiente húmedo.</li>
	<li>El día 5 después de la lactancia sanguínea, realice la recolección de embriones, la micromanipulación y la microinyección. Introduzca un papel de filtro húmedo en la cámara de puesta de huevos. Los embriones recién colocados no tienen un corion completamente desarrollado y parecen blancos. Utilice papel de filtro negro durante el procedimiento para facilitar la visualización de los embriones blancos.</li>
	<li>Transfiera un pequeño grupo de hembras de la olla de yeso a la cámara de puesta de huevos a través de los puertos laterales usando un aspirador de boca. La presencia de un sustrato húmedo (el papel filtrante) induce a las hembras a oviposit.</li>
	<li>Después de 30-60 min, recupere cuidadosamente el papel filtrante con embriones recién colocados de la cámara. Guarde el papel filtrante y los embriones en una placa de Petri durante un tiempo de hasta 3 horas. Durante este tiempo, evalúe regularmente el nivel de humedad del papel filtrante para asegurarse de que permanece húmedo. Durante este tiempo, repita los pasos 2.4 a 2.6 con nuevos grupos de hembras y recoja tantos embriones como sea posible.</li>
	<li>Preparar diapositivas de microscopio para la inyección: recoger manualmente los huevos uno por uno con un pincel muy fino y transferirlos cuidadosamente a otro pedazo de papel de filtro negro húmedo colocado en un tobogán de microscopio cubierto con un tubo de cubierta de vidrio.<ol>
<li>Agregue agua al papel filtrante, suficiente para mantener los embriones húmedos, pero no haciendo que floten lejos de la cubierta o siendo succionados bajo la cubierta. Alinee los embriones contra la mancha. La mancha de cubierta actúa como un backstop que impide que los huevos se desvíen durante la inyección.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Inyecciones de embriones (Figura 3)
<ol><li>Inicie las inyecciones de 2,5 a 3 horas después del inicio de la recogida de huevos. Realice inyecciones a temperatura ambiente y humedad ambiental del laboratorio.</li>
	<li>Asegúrese de que los embriones alineados tengan suficiente agua para que se mantengan húmedos. NOTA: Es fundamental que los embriones se mantengan húmedos durante las inyecciones. Si no están húmedos durante el proceso de inyección, las inyecciones se vuelven difíciles porque la aguja tiene problemas para perforar el embrión. La cantidad correcta de agua es el punto en el que los embriones tienen un menisco de agua a su alrededor, pero la mancha de cubierta no está flotando en la parte superior del agua causando que los embriones empujen debajo de la cubierta. Es fundamental controlar la cantidad de agua alrededor de los embriones durante las inyecciones. Agregue agua según sea necesario para mantener los embriones húmedos.</li>
	<li>Agregue el agua cuidadosamente mojando un cepillo con agua y transfiriendo el agua a la parte posterior del papel filtrante. La adición de agua de esta manera permite añadir agua de una manera lenta y controlada para que se agregue lo suficiente para mantener los embriones húmedos. Demasiada agua puede hacer que los embriones floten fuera de la alineación, lo que dificulta la inyección de los embriones.</li>
	<li>Mezcla de inyección de carga posterior en la aguja de microinjeción. Añadir aproximadamente 0,5 a 1 μL de mezcla de inyección en la aguja utilizando un relleno de aguja de borosilicato dibujado a mano, también se pueden utilizar puntas de pipete de carga de gel. La mezcla de inyección se compone de uno o varios ARN guía (80 ng/μL cada uno) diseñado para dirigirse a un locus específico mezclado con proteína Cas9 recombinante comercial (300 ng/μL).</li>
	<li>A partir de la presión de inyección a 30 psi, presione el disparador de inyección para expulsar el aire de la punta de la aguja. Esto forzará la mezcla de inyección a la punta de la aguja permitiendo que la mezcla de inyección fluya. En este punto, aumente lentamente la presión constante/de retención hasta que el material de inyección comience a fluir, luego vuelva a bajar la presión constante/de retención para que esté justo debajo del punto de la mezcla de inyección que fluye desde la aguja. El ajuste cerrado debe entregar suficiente material de inyección para que se pueda ver una pequeña cantidad de material para entrar en el embrión. NOTA: Inicialmente se probó la inyección de embriones de mosca de arena bajo aceite de halocarbono similar a otros protocolos utilizados para drosophila y mosquitos, sin embargo, el porcentaje de supervivencia para estas inyecciones fue muy bajo. La supervivencia se mejoró cambiando a inyecciones en papel filtrante húmedo como se describió anteriormente.</li>
	<li>Inserte la aguja en el lado del embrión. Utilice la mancha de cubierta detrás del embrión como un backstop que ayudará a la aguja a perforar el embrión. Entregue una pequeña cantidad de mezcla de inyección en el embrión antes de extraer suavemente la aguja.</li>
	<li>Inmediatamente después de retirar la aguja, presione el inyector para extraer cualquier material rellenado de la punta de la aguja. Esto ayudará a evitar que la aguja se obstruya.</li>
	<li>Proceda al siguiente embrión. Entre cada inyección, asegúrese de que el papel filtrante esté húmedo y que la aguja no esté obstruida.</li>
	<li>Una vez inyectados todos los embriones, cuente el número de embriones inyectados para mantener un recuento corriente.</li>
	<li>Retire la cubierta añadiendo agua al papel filtrante para que el tapatío flote. En este punto, utilice una sonda (palo aplicador de madera con pasador de insecto pegado a la punta) para mantener el papel filtrante en su lugar mientras se utiliza un dedo para tirar de la mancha de cubierta lejos de los embriones inyectados.</li>
	<li>Borres el exceso de agua del papel filtrante una vez que se haya eliminado el clip de cubierta.</li>
</ol>4. Crianza post-inyección (G0) (Figura 4)
<ol><li>Transfiera el papel filtrante con los embriones encima de varias capas de papel filtrante húmedo colocados en una placa De Petri para mantener la humedad. Mantenga los embriones aquí durante el tiempo necesario para inyectar otros embriones. Los embriones se pueden celebrar durante un máximo de 3 horas como este. Después de la inyección se volverán lentamente marrones.</li>
	<li>Una vez inyectados todos los embriones, transfiéralos manualmente a macetas de yeso de pequeño tamaño previamente humedecidas. No ponga demasiados embriones en cada maceta y mantenga la distancia entre ellos, para evitar una posible contaminación fúngica entre individuos. Cubra las macetas con una pantalla y guárdelas como se haría normalmente para los huevos de colonia de moscas de arena, mantenidas en incubadoras al 70% de humedad y a 26 °C, durante todo su desarrollo.</li>
	<li>El día 1 después de la inyección, retire todos los embriones dañados y muertos con un pincel. Añadir 100 μL de ácido propionico del 0,5%, gota a gota, en las macetas de yeso que contienen los embriones inyectados para limitar la contaminación fúngica. La liberación de citoplasma de embriones dañados durante el proceso de inyección es particularmente favorable para el crecimiento fúngico.</li>
	<li>Revise las macetas de yeso todos los días y retire cualquier embrión malo o muerto. Si el hongo está presente, retire todos los embriones infectados y agregue unas gotas de ácido propionico al 0,5%.</li>
	<li>Las larvas eclosionan entre el día 8 y 12 después de la inyección. Dos veces al día, transfiera las larvas recién emergidas a nuevas macetas de yeso, en grupos de máximo de 5-10. Agregue una pequeña cantidad de comida y revise la comida 2-3 veces a la semana.<ol>
<li>Controle cuidadosamente la cantidad de alimentos larvarios, ya que aumenta demasiado el riesgo de contaminación fúngica. Las larvas de mosca de arena sobreviven mejor en grupos, sin embargo, pueden ser caníbales si no hay suficiente comida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuando las larvas pupen, separe por sexo para mantener a las hembras como vírgenes. Si hay muchos sobrevivientes, deseche a los machos y mantenga sólo a las hembras. NOTA: Tanto los machos como las hembras pueden llevar y transmitir mutaciones. Sin embargo, como las hembras tienen que ser mantenidas vírgenes antes de que se crucen, es más fácil utilizar sólo las hembras inyectadas G0 para evitar tener que separar insectos wt por sexo. Los machos G0 se pueden mantener como refuerzo si el número de sobrevivientes adultos es bajo y en este caso serán apareados con hembras vírgenes wt ordenadas.</li>
</ol>5. Selección y cribado de alelos mutantes (Figura 5)
<ol><li>Cruza en masa a las hembras G0 con machos wt en una jaula. Ensangrente por completo, como se haría para el mantenimiento normal de colonias.</li>
	<li>Un día después de la alimentación en sangre, transfiera cada hembra G0 con machos de 2-3 wt en tubos de yeso individuales usando un aspirador bucal. Alimente las moscas con azúcar en una pequeña bola de algodón cambiada todos los días y use una jeringa de agua para asegurarse de que la humedad del yeso es adecuada para la puesta de huevos.</li>
	<li>Después de que las hembras G0 hayan puesto huevos (correspondientes a G1),recojan sus cuerpos en tubos Eppendorf individuales y anotados para genotipados posteriores. Mantener los embriones como se suele hacer para las colonias wt.</li>
	<li>Extraiga el ADN de las hembras G0 por el método de elección.</li>
	<li>Examine el ADN en busca de la presencia de mutaciones, por ejemplo diseñando un ensayo de PCR utilizando imprimaciones que rodean la región de los cortes CRISPR esperados.</li>
	<li>Mantenga sólo los embriones G1 colocados por las hembras G0 mostrando evidencia de transformación. Cuando estos embriones G1 se conviertan en pupas, separe por sexo y mantenga sólo a las hembras. Cruzar las hembras G1 de la misma hembra G0 a los machos wt, alimentarlos de sangre, luego transferir en pequeños grupos de 2-3 hembras y 4-5 machos en recipientes de tamaño pequeño. NOTA: Todos los individuos G1 tienen la oportunidad de llevar una mutación única, por lo que si el número de individuos sobrevivientes no es demasiado alto, entonces es mejor cruzar a las hembras G1 individualmente con machos wt. El caso de varias hembras portadoras de una mutación diferente presente en un mismo tubo es raro, pero puede ocurrir. Si tal caso se observa después del genotipado, las hembras progenies G2 deben aparearse individualmente a los machos wt. Este esquema de apareamiento evita la posibilidad de múltiples mutaciones en la progenie.</li>
	<li>Después de la puesta de huevos, recoger los cuerpos femeninos G1 y examinarlos en busca de mutaciones. Mantenga sólo los tubos donde al menos una hembra mostró evidencia de mutación.</li>
	<li>Para las generaciones posteriores, haga un solo par en cruces. Después de la puesta de huevos, examine a los padres en busca de presencia de mutación. Repita en cada generación hasta que ambos padres sean homocigóidos por la misma mutación. Una vez identificados, serán los fundadores de un stock mutante homocigógio.</li>
</ol>

<ol>
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Presentamos aquí un método de microinjección embrionaria recientemente desarrollado para la mutagénesis dirigida por CRISPR/Cas9 en moscas de arena Phlebotomus papatasi. La microinyección embrionaria para la modificación genética de insectos se desarrolló en Drosophila a mediados de la década de 198021 y ahora se utiliza rutinariamente en una amplia variedad de insectos. Se han desarrollado otros métodos para la entrega de materiales de modificación genética para su u...

Las enfermedades transmitidas por vectores son una de las principales amenazas para la salud pública en la evolución constante. Cientos de especies vectoriales repartidas entre familias filogengénicas muy distintas (por ejemplo, mosquitos, garrapatas, pulgas) son responsables de la transmisión de un gran número de patógenos microbianos, lo que resulta en más de 700.000 muertes humanas al año, según la Organización Mundial de la Salud. Entre los insectos vectoriales, las moscas de arena de fenbotomina (Diptera, Psicodidae) constituyen un vasto grupo, con 80 especies vectoriales probadas que exhiben rasgos fenotípicos distintos y capacidades vectoriales que se encuentran en diferentes regiones geográficas. Son vectores para los parásitos protozoicos del género Leishmania,causando alrededor de 1,3 millones de nuevos casos de Leishmaniases y entre 20.000 y 30.000 muertes al año. Los resultados clínicos de leishmaniases son diversos, con síntomas que van desde lesiones cutáneas autolimitantes hasta difusión visceral que es fatal en ausencia de tratamiento.
Las moscas de arena son insectos estrictamente terrestres. Su ciclo de vida, relativamente largo en comparación con otros Diptera, dura hasta tres meses, dependiendo de diferentes parámetros como la temperatura, la humedad y la nutrición. Consta de una etapa embrionaria (6 a 11 días), cuatro etapas larvarias (con una duración total de 23 a 25 días) y una etapa pupal (9 a 10 días) seguida de metamorfosis y luego la edad adulta. Las moscas de la arena requieren un ambiente húmedo y cálido para la cría. Tanto los machos como las hembras se alimentan de azúcares, obtenidos en la naturaleza a partir de néctares de flores. Sólo las hembras son alimentadoras de sangre, ya que requieren proteínas obtenidas de la harina de sangre para la producción de huevos1.
Un enfoque importante de la investigación es identificar la naturaleza de las interacciones vectoriales/parásitos que conducen al desarrollo de infecciones transmisibles. Al igual que con otros insectos vectoriales, se ha demostrado que los parámetros intrínsecos a las moscas de arena afectan su competencia vectorial, que se define como su capacidad para transportar y transmitir patógenos a sus huéspedes. Por ejemplo, la expresión de galectinas por el Phlebotomus papatasi sand fly midgut cells, actuando como receptores que reconocen componentes de la superficie del parásito, puede influir directamente en su competencia vectorial para Leishmania major2,3. La vía de respuesta inmune de insectos, Inmunodeficiencia (IMD), también es crucial para la competencia vectorial de mosca de arena Phlebotomus papatasi para Leishmania major4. Un papel crítico para las vías de respuesta inmune de insectos vectoriales en el control de su transmisión de patógenos infecciosos se ha notificado de manera similar en los mosquitos Aedes aegypti 5,6,7, en la mosca de la tsetse Glossina morsitans8,y en Anopheles gambiae mosquitos9,10.
Los estudios de las interacciones entre mosca de la arena/Leishmania se han visto limitados por la falta de métodos de modificación de la expresión génica adaptados para su uso en estos insectos. Sólo se había realizado la regulación de la bajada genética por ARN de interferencia pequeña (SIRNA)11,12,13,14 hasta hace poco. La técnica, limitada por la mortalidad asociada con la microinyección de las hembras adultas, conduce sólo a una pérdida parcial de la función, que no puede transmitirse de generación en generación.
La tecnología CRISPR/Cas9 ha revolucionado la investigación genómica funcional en organismos no modelo como las moscas de arena. Modificado desde el sistema inmune adaptativo en prokaryotes para la defensa contra bacteriófagos15,16, el sistema CRISPR Cas9 se ha adaptado rápidamente como una herramienta de edición del genoma para organismos eucariotas superiores, incluyendo insectos. El principio de la edición del genoma objetivo CRISPR/Cas9 se basa en la complementariedad de un ARN guía único (sgRNA) a un locus genómico específico. La nucleasa Cas9 se une al sgRNA y crea una rotura de ADN de doble hebra (dsDNA) en el ADN genómico donde el esgRNA se asocia con su secuencia complementaria. El complejo Cas9-sgRNA se guía a la secuencia de destino por 17 a 20 bases complementarias en el sgRNA al locus elegido, la rotura dsDNA puede ser reparada por dos vías independientes: unión final nohomóloga (NHEJ) o reparación dirigida por homología (HDR)17. La reparación de NHEJ implica un cierre simple de la rotura, pero con frecuencia conduce a pequeños eventos de inserción/eliminación. La reparación del ADN a través de HDR utiliza una molécula de ADN de donante que comparte la homología con el ADN objetivo como una plantilla para su reparación. Los insectos poseen ambas máquinas.
La tecnología CRISPR/Cas9 puede generar mutaciones en un locus elegido, a través de la vía de reparación del NHEJ; o para estrategias de edición del genoma más complejas, como knock-ins o reporteros de expresión, a través de la vía HDR con una plantilla de donante adecuada. En moscas de arena, se generaron alelos mutantes nulos del factor de respuesta inmune Sabor a través de CRISPR mediado por NHEJ en Phlebotomus papatasi4. También se inyectaron embriones de mosca de arena en otro estudio con una mezcla CRISPR/Cas9 dirigida al gen que codifica el amarillo. Aún así, no se produjeron adultos portadores de la mutación18. Aquí describimos un método detallado de mosca de arena dirigida mutagénesis por CRISPR/Cas9 mediada por NHEJ, con un enfoque particular en la microinyección embrionaria, un paso crítico del protocolo.

<table><tbody><tr><td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td><td>VWR</td><td>28342-012</td><td>Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-543A</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Any brand</td><td></td><td>For aligning embryos</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Base layer of the microinjection set up Figure 2A</td></tr><tr><td>Insect cage</td><td>custom made or several commercial options</td><td></td><td>polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &amp;ldquo;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&amp;rdquo; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Larval food</td><td>custom made</td><td></td><td>a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &amp;ldquo;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&amp;rdquo; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Microcaps 100 ml</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Used to back fill microinjection needles</td></tr><tr><td>Mouth aspirator</td><td>John W. Hock Company</td><td>Model 612</td><td>mouth aspirator with HEPA filter</td></tr><tr><td>Olympus SZX12</td><td>Olympus Life Sciences</td><td></td><td>Microinjection microscope</td></tr><tr><td>Ovipots</td><td>Nalge company</td><td></td><td>ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &amp;ldquo;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&amp;rdquo; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Paint Brush 6-0</td><td>Any Art Supply Company</td><td>n/a</td><td>Used for aligning embryos</td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td>antifungal agent</td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-3</td><td>Used for making microinjection needles</td></tr><tr><td>Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Microinjection Controller and Micromanipulator</td></tr></tbody></table>

sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis

Las moscas de la arena son los vectores naturales de las especies de Leishmania, parásitos protozoos que producen un amplio espectro de síntomas que van desde lesiones cutáneas hasta patología visceral. Descifrar la naturaleza de las interacciones vectoriales/parásitos es de importancia primordial para una mejor comprensión de la transmisión de Leishmania a sus huéspedes. Entre los parámetros que controlan la competencia de vectores de mosca de arena (es decir, su capacidad para transportar y transmitir patógenos), se demostró que los parámetros intrínsecos a estos insectos desempeñaban un papel clave. La respuesta inmune de los insectos, por ejemplo, afecta la competencia de vectores de mosca de arena a Leishmania. El estudio de estos parámetros se ha visto limitado por la falta de métodos de modificación de la expresión génica adaptados para su uso en estos organismos no modelo. La regulación genética por ARN de interferencia pequeña (SIRNA) es posible, pero además de ser técnicamente desafiante, el silenciamiento conduce a sólo una pérdida parcial de la función, que no se puede transmitir de generación en generación. La mutagénesis dirigida por la tecnología CRISPR/Cas9 fue recientemente adaptada a la mosca de arena Phlebotomus papatasi. Esta técnica conduce a la generación de mutaciones transmisibles en un locus elegido específicamente, lo que permite estudiar los genes de interés. El sistema CRISPR/Cas9 se basa en la inducción de roturas de ADN de doble hebra dirigidas, posteriormente reparadas por la Unión Final No Homologosa (NHEJ) o por la Reparación Impulsada por Homología (HDR). NHEJ consiste en un cierre simple de la rotura y con frecuencia conduce a pequeños eventos de inserción / eliminación. Por el contrario, HDR utiliza la presencia de una molécula de ADN donante que comparte homología con el ADN objetivo como una plantilla para su reparación. Aquí, presentamos un método de microinyección de embriones de mosca de arena para la mutagénesis dirigida por CRISPR/Cas9 utilizando NHEJ, que es la única técnica de modificación del genoma adaptada a los vectores de mosca de arena hasta la fecha.

El protocolo de microinyección CRISPR/Cas9 descrito aquí para generar mutantes de mosca de arena se estableció en una publicación anterior4. Este enfoque produjo mutagénesis altamente eficiente, ya que 11 de cada 540 individuos sobrevivieron al procedimiento, de los cuales 9 fueron mutantes. Al diseñar guías para la mutación CRISPR/Cas9, un primer paso crítico es secuenciar la región alrededor del área a la que se va a dirigir. La plantilla para la secuenciación debe ser de la cepa que...

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Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Este protocolo detalla los pasos de crispr/cas9 mutagénesis dirigida en moscas de arena: recolección de embriones, inyección, cría de insectos e identificación, así como selección de mutaciones de interés.

Mosca de arena (Phlebotomus papatasi) Microinjeción embrionaria para CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

7.1K vistas.  National Institutes of Health. Este protocolo detalla los pasos de crispr/cas9 mutagénesis dirigida en moscas de arena: recolección de embriones, inyección, cría de insectos e identificación, así como selección de mutaciones de interés.

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Investigación

Genética

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Inyecciones de embriones para la mutagénesis mediada por CRISPR en el saltador de la hormiga Harpegnathos

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

phiC31 Transgénesis embrionaria mediada por integrasa en Drosophila

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

Autor destacado: Optimización de la microinyección de embriones para la transgénesis en Drosophila

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

Edición del genoma del mosquito Aedes aegypti de la fiebre amarilla mediante CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Comportamiento

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

Mosca de arena (Phlebotomus papatasi) Microinjeción embrionaria para CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Resumen

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Capítulos en este video

Entrega de ácidos nucleicos mediante microinyección de embriones en el Mundial de la Agricultura de plagas de insectos,

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

Inyecciones de embriones para la mutagénesis mediada por CRISPR en el saltador de la hormiga Harpegnathos

Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

Microinyección embrionaria para la transgénesis en Drosophila

Edición del genoma del mosquito Aedes aegypti de la fiebre amarilla mediante CRISPR-Cas9

Microinyección embrionaria e identificación de mutantes knockout de Helicoverpa armigera editada por el genoma CRISPR/Cas9 (Hübner)

Microinyección de saltamontes de maíz, Peregrinus maidis, embriones para la edición del genoma CRISPR/Cas9