저자들은 원고의 비판적 독서에 대한 바네사 멜데너 - 해럴에게 감사드립니다.

모래 파리 먹이 공급에 대 한 혈액의 소스로 마우스의 사용은 건강의 국가 학회 (NIH)의 실험실 동물의 관리 및 사용에 대 한 가이드에 있는 권고에 따라 엄격한 수행 되었다. 이 프로토콜은 NIAID, NIH (프로토콜 번호 LPD 68E)의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다. 무척추 동물은 NIH 지침에 따라 적용되지 않습니다.
1. 바늘 준비(그림 1)
<ol><li>Meuti와 해럴19에설명된 대로 바늘과 벨을 당깁니다. 간단히 말해서, 보로실리케이트 유리 모세혈관을 사용하여 이중 단계 유리 마이크로 피펫 풀러에 바늘을 당깁니다.</li>
	<li>여분의 미세 한 돌을 사용하여 마이크로 피펫 베벨러에 젖은 베브링하여 바늘을 날카롭게.</li>
</ol>2. 배아 수집 및 미세 조작(그림 2)
<ol><li>주사일 5일 전에, 혈액 사료 모래는 식민지 유지 보수를 위해 일상적으로 수행된 암컷을 비행합니다. 모래 파리 식민지 사육 절차 및 필수 재료에 대한 자세한 내용은, 변호사 등을 참조하십시오.1 인큐베이터에서 곤충을 유지 70% 습도 및 26°C, 전체 개발 하는 동안.<ol>
<li>어느 날 혈액 먹이 후, 측면 포트와 석고 냄비에 100-150의 그룹에 의해 혈액 공급 여성을 캡처합니다. 식민지 유지 보수에 보통 설탕 용액 (30 % 자당 - 작은 면공을 담을 수있는 충분한 볼륨)으로 여성을 유지하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2-3 일째에 혈액 을 먹이는 날에석 냄비를 적시지 마십시오. 건조한 기판에 암컷을 유지하는 것은 암컷이 습한 환경에 계란을 낳는 것을 선호하기 때문에, 조기 계란 누워를 방지할 것입니다.</li>
	<li>5일째에는 혈액 먹이주기 후 배아 수집, 미세 조작 및 미세 주입을 수행합니다. 달걀 누워 챔버에 촉촉한 필터 용지를 소개합니다. 갓 낳은 배아는 완전히 발달된 초리온이 없으며 흰색으로 나타납니다. 절차 중에 검은 색 필터 용지를 사용하여 백색 배아를 시각화합니다.</li>
	<li>입 흡인기를 사용하여 측면 포트를 통해 계란 누워 챔버에 석고 냄비에서 여성의 작은 그룹을 전송합니다. 습한 기판 (필터 종이)의 존재는 배란을 유도한다.</li>
	<li>30-60 분 후, 조심스럽게 챔버에서 새로 배치 된 배아와 필터 용지를 검색합니다. 필터 용지와 배아를 페트리 접시에 최대 3시간 동안 보관하십시오. 이 기간 동안 필터 용지의 수분 수준을 정기적으로 평가하여 촉촉하게 유지되도록 합니다. 이 시간 도중, 여성의 새로운 단과 2.4에서 2.6 단계를 반복하고 가능한 한 많은 배아를 수집합니다.</li>
	<li>주입을 위한 현미경 슬라이드 준비: 매우 미세한 페인트 브러시로 계란을 하나씩 수동으로 수집하고 유리 커버슬립을 얹은 현미경 슬라이드에 놓인 습한 검은 색 필터 용지로 조심스럽게 옮기십시오.<ol>
<li>필터 용지에 물을 추가하여 배아를 촉촉하게 유지하지만 덮개 슬립에서 벗어나거나 덮개 슬립 아래에 빨려 들어가지 않습니다. 커버슬립에 배아를 정렬합니다. 커버슬립은 주사 중에 계란이 굴러가는 것을 막는 백스톱 역할을 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 배아 주사(그림 3)
<ol><li>주사를 시작 2.5 받는 시간 3 계란 수집의 시작 시간 후. 실온 및 주변 실험실 습도에서 주사를 수행합니다.</li>
	<li>정렬된 배아가 충분한 물을 가지고 있어야 촉촉하게 유지되도록 하십시오. 참고: 배아는 주사 중에 촉촉하게 유지되는 것이 중요합니다. 주사 과정에서 촉촉하지 않으면 바늘이 배아를 관통하는 데 어려움을 겪기 때문에 주사가 어려워집니다. 정확한 양의 물은 배아가 그 주위에 물의 반월상 연골을 가지고 있는 지점이지만, 커버슬립은 배아가 덮개 슬립 아래 를 밀어 일으키는 물 위에 떠 있지 않습니다. 주사 하는 동안 배아 주위 물의 양을 모니터링 하는 것이 중요 하다. 배아를 촉촉하게 유지하기 위해 필요에 따라 물을 추가합니다.</li>
	<li>브러시를 물로 적시고 물을 필터 용지의 뒷쪽 끝으로 옮기면 조심스럽게 물을 추가합니다. 이러한 방식으로 물을 첨가하면 물을 느리고 제어된 방식으로 첨가하여 배아를 촉촉하게 유지하기에 충분합니다. 물이 너무 많으면 배아가 정렬되지 않도록 하여 배아를 주입하기가 어려워질 수 있습니다.</li>
	<li>백 로드 주입 혼합물을 미세 주입 바늘에 넣습니다. 손으로 그린 보로실리케이트 바늘 필러를 사용하여 바늘에 약 0.5 ~ 1 μL의 주입 믹스를 추가, 젤 로딩 파이펫 팁도 사용할 수 있습니다. 사출 혼합물은 상업용 재조합 Cas9 단백질(300 ng/μL)과 혼합된 특정 궤적을 대상으로 설계된 하나 또는 여러 가이드 RNA(80 ng/μL 각각)로 구성된다.</li>
	<li>30 psi에서 사출 압력으로 시작, 바늘의 끝에서 공기를 배출 하는 주입 트리거를 누릅니다. 이것은 주입 믹스가 흐를 수 있도록 바늘의 끝에 주입 믹스를 강제로. 이 시점에서, 사출 물질이 흐르기 시작할 때까지 홀드/일정한 압력을 천천히 증가시킨 다음, 바늘에서 흐르는 주입 믹스의 지점 바로 아래에 있도록 홀드/일정한 압력을 다시 해제합니다. 문이 닫힌 설정은 소량의 물질이 배아에 들어가는 것을 볼 수 있도록 충분한 주입 물질을 전달해야합니다. 참고: Drosophila와 모기에 사용되는 다른 프로토콜과 유사한 할로탄소 오일 하에서 모래 플라이 배아의 주입은 처음에 테스트되었지만 이러한 주사의 생존 율은 매우 낮았습니다. 생존은 위에서 설명한 바와 같이 축축한 필터 용지에 주사로 전환하여 향상되었다.</li>
	<li>바늘을 배아의 측면에 삽입합니다. 배아 뒤에 있는 커버슬립을 배아를 관통하는 바늘을 돕는 백스톱으로 사용하십시오. 바늘을 부드럽게 제거하기 전에 소량의 주사 믹스를 배아에 전달합니다.</li>
	<li>바늘을 제거 한 직후 인젝터를 눌러 바늘 끝에서 백필 된 물질을 제거하십시오. 이것은 바늘이 막히는 것을 방지하는 데 도움이 될 것입니다.</li>
	<li>다음 배아로 진행합니다. 각 주입 사이에 필터 용지가 촉촉하고 바늘이 막히지 않도록하십시오.</li>
	<li>일단 모든 태아가 주입되면, 실행 집계를 유지하기 위해 주입 된 배아의 수를 계산합니다.</li>
	<li>커버슬립이 떠 있도록 필터 용지에 물을 추가하여 커버슬립을 제거합니다. 이 시점에서, 프로브(팁에 붙어 있는 곤충 핀이 있는 목재 어플리케이터 스틱)를 사용하여 손가락이 주입된 배아로부터 덮개 슬립을 당기는 데 사용되는 동안 필터 용지를 제자리에 고정시합니다.</li>
	<li>커버슬립이 제거되면 필터 용지에서 여분의 물을 블롯합니다.</li>
</ol>4. 사출 후 양육 (G0)(그림 4)
<ol><li>습도를 유지하기 위해 페트리 접시에 놓인 습한 필터 용지의 여러 층 위에 배아를 사용하여 필터 용지를 전달합니다. 다른 배아를 주입하는 데 필요한 시간 동안 여기에 배아를 유지합니다. 배아는 이와 같이 3 시간 동안 최대 3 시간 동안 보유 될 수 있습니다. 주사 후 그들은 천천히 갈색으로 변합니다.</li>
	<li>일단 모든 배아가 주입되면, 수동으로 이전에 촉촉한 작은 크기의 석고 냄비에 전송. 각 냄비에 너무 많은 배아를 넣고 개인 사이의 가능한 곰팡이 오염을 피하기 위해 그들 사이의 거리를 유지하지 마십시오. 냄비를 화면으로 덮고 일반적으로 모래 파리 식민지 계란을 위해 수행 될 것 같이 저장, 70 % 습도및 26 °C에서 인큐베이터에서 유지, 전체 개발 하는 동안.</li>
	<li>1일째 주사 후, 페인트 브러시로 손상된 배아와 죽은 배아를 모두 제거하십시오. 곰팡이 오염을 제한하기 위해 주입 된 배아를 포함하는 석고 냄비에 0.5 % 프로피온산의 100 μL을 추가합니다. 주입 과정에서 손상된 배아로부터 세포질 방출은 곰팡이 성장에 특히 유리하다.</li>
	<li>매일 석고 냄비를 확인하고 나쁜 또는 죽은 배아를 제거하십시오. 곰팡이가 존재하는 경우 감염된 모든 배아를 제거하고 0.5 % 프로피오닉 산을 몇 방울 떨어 뜨립니다.</li>
	<li>8일과 12일 사이에 유충부 부화. 하루에 두 번, 5-10 최대의 그룹으로, 새로운 석고 냄비에 새로 등장 애벌레를 전송합니다. 소량의 음식을 추가하고 일주일에 2-3 번 음식을 확인하십시오.<ol>
<li>너무 많이 곰팡이 오염의 위험을 증가으로 조심스럽게 애벌레 음식의 양을 모니터링할 수 있습니다. 모래 파리 유충은 그룹에서 더 잘 살아남을 수 있지만 충분한 음식이 없다면 식인풍이 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>애벌레가 강아지를 때, 처녀로 여성을 유지하기 위해 섹스로 그들을 분리. 생존자가 많으면 남성을 버리고 여성만 유지하십시오. 참고: 남성과 여성 모두 돌연변이를 운반하고 전송할 수 있습니다. 그러나, 암컷이 교차되기 전에 처녀를 유지해야하기 때문에, G0 주입 된 여성만 섹스를 통해 wt 곤충을 분리할 필요가 없도록 사용하는 것이 더 쉽습니다. G0 남성은 성인 생존자의 수가 낮고이 경우 정렬 wt 처녀 여성과 결합 될 경우 백업으로 보관 할 수 있습니다.</li>
</ol>5. 돌연변이 진상규약의 선택 및 선별(그림 5)
<ol><li>케이지에 wt 수컷을 가진 G0 암컷을 매스 크로스합니다. 정상적인 식민지 유지 보수를 위해 할 것처럼 혈액 공급은 모두 그들을 공급합니다.</li>
	<li>언젠가 혈액 먹이 후, 입 흡인기를 사용하여 개별 석고 튜브로 2-3 wt 남성으로 각 G0 여성을 전송합니다. 매일 변경된 작은 면공에 설탕으로 파리를 먹이고 석고 수분이 달걀 누워에 적합한지 확인하기 위해 물 주사기를 사용하십시오.</li>
	<li>G0 암컷이 계란을 낳은 후 (G1에해당), 나중에 지노티핑에 대한 개별, 에펜도르프 튜브에 자신의 시체를 수집합니다. wt 식민지를 위해 일반적으로 행해진 것처럼 배아를 유지하십시오.</li>
	<li>선택 방법에 의해 G0 암컷으로부터 DNA를 추출한다.</li>
	<li>예를 들어 예상되는 CRISPR 컷 영역을 둘러싼 프라이머를 사용하여 PCR 분석기를 설계하여 돌연변이의 존재를 위한 DNA를 검사합니다.</li>
	<li>G0 암컷이 낳은 G1 배아만 변혁의 증거를 보여 줌으로써 보관하십시오. 이 G1 배아가 강아지로 발전할 때, 성별에 의해 그(것)들을 분리하고 단지 암컷을 유지합니다. 같은 G0 암컷에서암컷을 배회하여 수컷을 낳고, 혈액을 공급한 다음, 2-3 암컷과 4-5명의 수컷을 작은 크기의 용기로 옮긴다. 참고 : 모든 G1 개인은 독특한 돌연변이를 수행 할 수있는 기회가, 그래서 살아남은 개인의 수가 너무 높지 않은 경우 다음 wt 남성과 개별적으로 G1 여성을 교차하는 것이 좋습니다. 동일한 튜브에 존재하는 다른 돌연변이를 운반하는 여러 여성의 경우는 드물지만 발생할 수 있습니다. 이러한 경우 지평 후 관찰 하는 경우, G2 자손 여성 다음 wt 남성에 개별적으로 짝짓기 한다. 이 짝짓기 계획은 자손에서 다중 돌연변이의 가능성을 피합니다.</li>
	<li>계란 누워 후, G1 여성의 시체를 수집하고 돌연변이를 검사합니다. 적어도 한 명의 여성이 돌연변이의 증거를 보인 튜브만 보관하십시오.</li>
	<li>이후 세대를 위해 하나의 쌍 인 크로스를 합니다. 계란 누워 후, 돌연변이의 존재를 위한 부모를 검사합니다. 두 부모가 동일한 돌연변이에 대한 동종 구균 될 때까지 각 세대에서 반복합니다. 일단 확인되면, 그들은 동종 돌연변이 주식의 창시자가 될 것입니다.</li>
</ol>

<ol>
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우리는 여기에 Phlebotomus 파파타시 모래 파리에서 CRISPR / Cas9에 의해 표적 돌연변이 발생을위한 최근에 개발 된 배아 미세 주입 방법을 제시한다. 곤충 유전자 변형을 위한 배아 미세주입은 1980년대 중반에 드로소필라에서 개발되었으며 현재 다양한 곤충에서 일상적으로 사용되고 있다. 유전자 변형 물질의 전달을 위한 다른 방법은 ReMOT20,<sup class="xr...

벡터 매개 질병은 지속적인 진화의 주요 공중 보건 위협입니다. 세계보건기구(WHO)에 따르면, 수백 종의 벡터 종들이 매우 뚜렷한 물리학 상가(예: 모기, 진드기, 벼룩)의 엄청난 수의 미생물 병원체 의 전염에 책임이 있으며, 이로 인해 연간 70만 명 이상의 인명 사망이 발생한다고 합니다. 벡터 곤충 중, 플레보토민 모래 파리 (Diptera, Psychodidae)는 다른 지리적 지역에서 발견 된 뚜렷한 현상 특성과 벡터 용량을 나타내는 80 입증 된 벡터 종과 함께 광대 한 그룹을 구성합니다. 그(것)들은 사이 20,000그리고 30,000죽음 사이 Leishmanias의 약 130만의 새로운 케이스를 일으키는 원인이 되는 속 Leishmania의원생동물 기생충을 위한 벡터입니다. Leishmaniases 임상 결과는 다양합니다, 치료의 부재에서 치명적인 내장 보급에 자기 제한 적인 경골 병변에서 구역 수색에 이르기까지 현상으로.
모래 파리는 엄격하게 지상파 곤충입니다. 그들의 수명 주기, 다른 Diptera에 비해 상대적으로 긴, 온도 등 다른 매개 변수에 따라 최대 3 개월 지속, 습도, 그리고 영양. 그것은 1개의 배아 단계 (6 11 일), 4개의 애벌레 단계 (총 23 에서 25 일 지속) 및 1개의 pupal 단계 (9 10 일) 그 후에 변질 및 그 후에 성인으로 이루어져 있습니다. 모래 파리는 사육을 위해 습하고 따뜻한 환경이 필요합니다. 남성과 여성 모두 꽃 꿀에서 야생에서 얻은 설탕을 먹습니다. 오직 여성만이 혈액 공급제이며, 계란 생산을 위해 혈액 식사에서 얻은 단백질을 필요로 하기 때문에1.
연구의 중요한 초점은 전염성 감염의 발달로 이끌어 내는 벡터/기생충 상호 작용의 본질을 확인하는 것입니다. 다른 벡터 곤충과 마찬가지로, 모래 파리에 본질적인 매개 변수는 그들의 벡터 능력에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다., 그들의 호스트에 병원체를 운반 하 고 전송 하는 그들의 능력으로 정의. 예를 들어, 플레보토무스 파파타시 모래에 의한 갈렉틴의 발현은 기생충 표면 성분을 인식하는 수용체역할을 하는 미드구트 세포를 비행하며, 리슈마니아 전공2,3에대한 벡터 역량에 직접적인 영향을 미칠 수 있다. 곤충 면역 반응 경로, 면역 결핍 (IMD), 또한 Leishmania 주요4에대 한 Phlebotomus 파파타시 모래 플라이 벡터 능력에 대 한 중요 한. 전염하는 병원체의 전염을 조절하는 벡터 곤충 면역 반응 경로에 대한 중요한 역할은 Aedes aegypti 모기5,6,7,체셋 플라이 글로시나 모시탄8,및 아노펠스 감비아 모기9,10에서유사하게 보고되었다.
모래 파리/Leishmania 상호 작용의 연구는 이 곤충에 사용하기 위해 적응된 유전자 발현 수정 방법의 부족에 의해 제한되었습니다. 작은 간섭 RNA(siRNA)에 의한 유전자 다운조절만은 최근까지11,12,13,14를 수행하였다. 이 기술은 성인 여성의 미세 주입과 관련된 사망률에 의해 제한되며, 세대에서 세대로 전염될 수 없는 기능의 부분적인 손실로만 이어집니다.
CRISPR/Cas9 기술은 모래 파리와 같은 비모델 유기체에서 기능성 게놈 연구에 혁명을 일으켰습니다. 세균제에대한 방어를 위한 대핵생물의 적응형 면역 계통으로부터 변형된 CRISPR Cas9 시스템은 곤충을 포함한 우수한 진핵생물을 위한 게놈 편집 도구로 빠르게 적응되고 있다. CRISPR/Cas9 표적 게놈 편집의 원리는 특정 게놈 궤적에 대한 단일 가이드 RNA(sgRNA)의 상호 보완성을 기반으로 합니다. Cas9 핵은 sgRNA에 결합하고 sgRNA가 그것의 보완적인 순서와 연관되는 게놈 DNA에 있는 이중 가닥 DNA (dsDNA) 중단을 만듭니다. Cas9-sgRNA 복합체는 SgRNA에서 17~20개의 상호 보완염기까지 표적 서열로 유도되며, dsDNA 브레이크는 두 개의 독립적인 경로에 의해 수리될 수 있다: 비homologous 엔드 결합(NHEJ) 또는 호모로지 지향 수리(HDR)17. NHEJ 수리는 휴식의 간단한 폐쇄를 포함하지만 자주 작은 삽입 / 삭제 이벤트로 이어질. HDR을 통한 DNA 복구는 기증자 DNA 분자가 표적 DNA와 상동성을 수리하기 위한 템플릿으로 사용합니다. 곤충은 두 기계를 모두 보유하고 있습니다.
CRISPR/Cas9 기술은 NHEJ 수리 경로를 통해 선택한 궤적에서 돌연변이를 생성할 수 있습니다. 또는 적절한 기증자 템플릿이 있는 HDR 경로를 통해 노크 인 또는 발현 기자와 같은 보다 복잡한 게놈 편집 전략을 위해. 모래 파리에서, 면역 반응 인자의 null 돌연변이 알렐레는 Phlebotomus 파파타시4에서NHEJ 매개 CRISPR을 통해 생성되었다. 모래 플라이 배아는 또한 CRISPR/Cas9 혼합으로 또 다른 연구에서 주입되었다 노란색을 인코딩 하는 유전자를 대상으로. 그럼에도 불구하고 돌연변이를 운반하는 성인은18을생산하지 않았다. 우리는 여기에서 NHEJ 매개 CRISPR/Cas9에 의한 표적 돌연변이 발생의 상세한 방법을 설명하고, 특히 프로토콜의 중요한 단계인 배아 미세 주입에 중점을 둡니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28342-012</td>
			<td>Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-543A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Base layer of the microinjection set up Figure 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect cage</td>
			<td>custom made or several commercial options</td>
			<td></td>
			<td>polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval food</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcaps 100 ml</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-1000</td>
			<td>Used to back fill microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth aspirator</td>
			<td>John W. Hock Company</td>
			<td>Model 612</td>
			<td>mouth aspirator with HEPA filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX12</td>
			<td>Olympus Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovipots</td>
			<td>Nalge company</td>
			<td></td>
			<td>ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brush 6-0</td>
			<td>Any Art Supply Company</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used for aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402907</td>
			<td>antifungal agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td>Used for making microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection Controller and Micromanipulator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis

모래 파리는 리슈마니아 종, 원생 동물 기생충에 대 한 자연 벡터 피부 병 변에서 내장 병 리 에 이르기까지 증상의 광범위 한 스펙트럼을 생산. 벡터/기생충 상호 작용의 본질을 해독하는 것은 그들의 호스트에 Leishmania 전송의 더 나은 이해를 위한 1차적인 중요성입니다. 모래 플라이 벡터 역량(즉, 병원체를 운반하고 전송하는 능력)을 제어하는 파라미터 중에서도 이러한 곤충에 내재된 파라미터가 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 곤충 면역 반응은 예를 들어, 리슈마니아에모래 플라이 벡터 능력에 영향을 미친다. 이러한 매개 변수의 연구는 이러한 비모델 유기체에서 사용하기 위해 적응된 유전자 발현 변형 방법의 부족에 의해 제한되었다. 작은 간섭 RNA에 의한 유전자 다운 조절은 가능하지만 기술적으로 도전적일 뿐만 아니라 침묵은 세대에서 세대로 전염될 수 없는 기능의 부분적인 손실로 이어집니다. CRISPR/Cas9 기술에 의한 표적 돌연변이 발생은 최근에 Phlebotomus 파파타시 모래 파리에 적응되었습니다. 이 기술은 관심있는 유전자를 공부할 수 있도록, 특별히 선택된 궤적에 있는 전송 가능한 돌연변이의 생성으로 이끌어 냅니다. CRISPR/Cas9 시스템은 대상 이중 가닥 DNA 휴식의 유도에 의존하며, 나중에 비동호모로우스 엔드 인게이션(NHEJ) 또는 호모로지 구동 수리(HDR)에 의해 수리됩니다. NHEJ는 휴식의 간단한 폐쇄로 구성되어 있으며 종종 작은 삽입 / 삭제 이벤트로 이어집니다. 대조적으로, HDR은 기증자 DNA 분자가 표적 DNA와 상동성을 수리가 위한 템플릿으로 사용하는 것을 이용합니다. 여기서, 현재까지 모래파리 벡터에 적응된 유일한 게놈 변형 기술인 NHEJ를 사용하여 CRISPR/Cas9에 의한 표적 돌연변이 발생을 위한 모래플라이 배아 미세주입 방법을 제시한다.

모래 파리 돌연변이를 생성하기 위해 여기에 설명 된 CRISPR / Cas9 미세 주입 프로토콜은 이전 간행물4에설립되었다. 이 접근법은 540명의 개별 중 11개가 절차에서 살아남았기 때문에, 9는 돌연변이인 이기 때문에 고도로 효율적인 돌연변이 발생을 일으켰습니다. CRISPR/Cas9 돌연변이에 대한 가이드를 설계할 때 중요한 첫 번째 단계는 대상 영역 주변의 영역을 시퀀싱하는 것입니다. ?...

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Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

이 프로토콜은 태아 수집, 주사, 곤충 사육 및 식별뿐만 아니라 관심있는 돌연변이의 선택 : 모래 파리에 CRISPR / Cas9 표적 돌연변이 발생의 단계를 자세히 설명합니다.

샌드 플라이 (플레보토무스 파파타시) CRISPR/Cas9 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

7.0K 조회수.  National Institutes of Health. 이 프로토콜은 태아 수집, 주사, 곤충 사육 및 식별뿐만 아니라 관심있는 돌연변이의 선택 : 모래 파리에 CRISPR / Cas9 표적 돌연변이 발생의 단계를 자세히 설명합니다.

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Xenopus 에 Leapfrogging CRISPR/Cas9-기반에 대 한 원시 생식 세포 이식

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

연구

유전학

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

태아 Microinjection 및 Nasonia vitripennis 게놈 조작을 위한 이식 기술

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

인간에서 태그 생 단백질 유도 만능 줄기 세포를 사용 하 여 CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

인간 다능성 줄기 세포에서 CRISPR-CAS9를 사용하여 정의된 게놈 수정 생성

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

필라멘트 아콤유세테 헌티엘라 오만시스에서 CRISPR-Cas9 중재 게놈 편집

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

컬렉스 퀸케파시아투스의 효율적인 부위 별 돌연변이 발생을 위한 배아 미세 주입 기술

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

개미 하르페냐토스 염기 에서 CRISPR 매개 돌연변이 유발을 위한 배아 주사

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...