Los autores agradecen a Vanessa Meldener-Harrell por la lectura crítica del manuscrito.

El uso de ratones como fuente de sangre para la alimentación de moscas de arena se llevó a cabo de acuerdo con las recomendaciones de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud (NIH). El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del NIAID, NIH (número de protocolo LPD 68E). Los invertebrados no están cubiertos por las directrices de los NIH.
1. Preparación de la aguja (Figura 1)
<ol><li>Tire de agujas y bisel como se describe en Meuti y Harrell19. Brevemente, tire de agujas en un extractor de micropipette de vidrio de doble etapa, utilizando capilares de vidrio borosilicato.</li>
	<li>Afilar las agujas al biselar húmedo en el biselador de micropipette, utilizando una piedra extra fina.</li>
</ol>2. Colección de embriones y micromanipulación (Figura 2)
<ol><li>Cinco días antes del día de la inyección, las hembras de arena de ensangrendero se realizan rutinariamente para el mantenimiento de colonias. Para obtener más información sobre los procedimientos de cría de colonias de moscas de arena y el material requerido, consulte Abogado et al.1 Mantenga los insectos en incubadoras al 70% de humedad y a 26 °C, durante todo su desarrollo.<ol>
<li>Un día después de la alimentación en la sangre, capturar hembras alimentadas con sangre por grupos de 100-150 en macetas de yeso con un puerto lateral. Mantener a las hembras alimentándolas con solución de azúcar (30% sacarosa – suficiente volumen para remojar una pequeña bola de algodón) que es habitual para el mantenimiento de colonias.</li>
	</ol>
</li>
	<li>En el día 2-3 después de la alimentación en la sangre, NO humedezca las ollas de yeso. Mantener a las hembras en un sustrato seco evitará la puesta prematura de huevos, ya que las hembras prefieren poner huevos en un ambiente húmedo.</li>
	<li>El día 5 después de la lactancia sanguínea, realice la recolección de embriones, la micromanipulación y la microinyección. Introduzca un papel de filtro húmedo en la cámara de puesta de huevos. Los embriones recién colocados no tienen un corion completamente desarrollado y parecen blancos. Utilice papel de filtro negro durante el procedimiento para facilitar la visualización de los embriones blancos.</li>
	<li>Transfiera un pequeño grupo de hembras de la olla de yeso a la cámara de puesta de huevos a través de los puertos laterales usando un aspirador de boca. La presencia de un sustrato húmedo (el papel filtrante) induce a las hembras a oviposit.</li>
	<li>Después de 30-60 min, recupere cuidadosamente el papel filtrante con embriones recién colocados de la cámara. Guarde el papel filtrante y los embriones en una placa de Petri durante un tiempo de hasta 3 horas. Durante este tiempo, evalúe regularmente el nivel de humedad del papel filtrante para asegurarse de que permanece húmedo. Durante este tiempo, repita los pasos 2.4 a 2.6 con nuevos grupos de hembras y recoja tantos embriones como sea posible.</li>
	<li>Preparar diapositivas de microscopio para la inyección: recoger manualmente los huevos uno por uno con un pincel muy fino y transferirlos cuidadosamente a otro pedazo de papel de filtro negro húmedo colocado en un tobogán de microscopio cubierto con un tubo de cubierta de vidrio.<ol>
<li>Agregue agua al papel filtrante, suficiente para mantener los embriones húmedos, pero no haciendo que floten lejos de la cubierta o siendo succionados bajo la cubierta. Alinee los embriones contra la mancha. La mancha de cubierta actúa como un backstop que impide que los huevos se desvíen durante la inyección.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Inyecciones de embriones (Figura 3)
<ol><li>Inicie las inyecciones de 2,5 a 3 horas después del inicio de la recogida de huevos. Realice inyecciones a temperatura ambiente y humedad ambiental del laboratorio.</li>
	<li>Asegúrese de que los embriones alineados tengan suficiente agua para que se mantengan húmedos. NOTA: Es fundamental que los embriones se mantengan húmedos durante las inyecciones. Si no están húmedos durante el proceso de inyección, las inyecciones se vuelven difíciles porque la aguja tiene problemas para perforar el embrión. La cantidad correcta de agua es el punto en el que los embriones tienen un menisco de agua a su alrededor, pero la mancha de cubierta no está flotando en la parte superior del agua causando que los embriones empujen debajo de la cubierta. Es fundamental controlar la cantidad de agua alrededor de los embriones durante las inyecciones. Agregue agua según sea necesario para mantener los embriones húmedos.</li>
	<li>Agregue el agua cuidadosamente mojando un cepillo con agua y transfiriendo el agua a la parte posterior del papel filtrante. La adición de agua de esta manera permite añadir agua de una manera lenta y controlada para que se agregue lo suficiente para mantener los embriones húmedos. Demasiada agua puede hacer que los embriones floten fuera de la alineación, lo que dificulta la inyección de los embriones.</li>
	<li>Mezcla de inyección de carga posterior en la aguja de microinjeción. Añadir aproximadamente 0,5 a 1 μL de mezcla de inyección en la aguja utilizando un relleno de aguja de borosilicato dibujado a mano, también se pueden utilizar puntas de pipete de carga de gel. La mezcla de inyección se compone de uno o varios ARN guía (80 ng/μL cada uno) diseñado para dirigirse a un locus específico mezclado con proteína Cas9 recombinante comercial (300 ng/μL).</li>
	<li>A partir de la presión de inyección a 30 psi, presione el disparador de inyección para expulsar el aire de la punta de la aguja. Esto forzará la mezcla de inyección a la punta de la aguja permitiendo que la mezcla de inyección fluya. En este punto, aumente lentamente la presión constante/de retención hasta que el material de inyección comience a fluir, luego vuelva a bajar la presión constante/de retención para que esté justo debajo del punto de la mezcla de inyección que fluye desde la aguja. El ajuste cerrado debe entregar suficiente material de inyección para que se pueda ver una pequeña cantidad de material para entrar en el embrión. NOTA: Inicialmente se probó la inyección de embriones de mosca de arena bajo aceite de halocarbono similar a otros protocolos utilizados para drosophila y mosquitos, sin embargo, el porcentaje de supervivencia para estas inyecciones fue muy bajo. La supervivencia se mejoró cambiando a inyecciones en papel filtrante húmedo como se describió anteriormente.</li>
	<li>Inserte la aguja en el lado del embrión. Utilice la mancha de cubierta detrás del embrión como un backstop que ayudará a la aguja a perforar el embrión. Entregue una pequeña cantidad de mezcla de inyección en el embrión antes de extraer suavemente la aguja.</li>
	<li>Inmediatamente después de retirar la aguja, presione el inyector para extraer cualquier material rellenado de la punta de la aguja. Esto ayudará a evitar que la aguja se obstruya.</li>
	<li>Proceda al siguiente embrión. Entre cada inyección, asegúrese de que el papel filtrante esté húmedo y que la aguja no esté obstruida.</li>
	<li>Una vez inyectados todos los embriones, cuente el número de embriones inyectados para mantener un recuento corriente.</li>
	<li>Retire la cubierta añadiendo agua al papel filtrante para que el tapatío flote. En este punto, utilice una sonda (palo aplicador de madera con pasador de insecto pegado a la punta) para mantener el papel filtrante en su lugar mientras se utiliza un dedo para tirar de la mancha de cubierta lejos de los embriones inyectados.</li>
	<li>Borres el exceso de agua del papel filtrante una vez que se haya eliminado el clip de cubierta.</li>
</ol>4. Crianza post-inyección (G0) (Figura 4)
<ol><li>Transfiera el papel filtrante con los embriones encima de varias capas de papel filtrante húmedo colocados en una placa De Petri para mantener la humedad. Mantenga los embriones aquí durante el tiempo necesario para inyectar otros embriones. Los embriones se pueden celebrar durante un máximo de 3 horas como este. Después de la inyección se volverán lentamente marrones.</li>
	<li>Una vez inyectados todos los embriones, transfiéralos manualmente a macetas de yeso de pequeño tamaño previamente humedecidas. No ponga demasiados embriones en cada maceta y mantenga la distancia entre ellos, para evitar una posible contaminación fúngica entre individuos. Cubra las macetas con una pantalla y guárdelas como se haría normalmente para los huevos de colonia de moscas de arena, mantenidas en incubadoras al 70% de humedad y a 26 °C, durante todo su desarrollo.</li>
	<li>El día 1 después de la inyección, retire todos los embriones dañados y muertos con un pincel. Añadir 100 μL de ácido propionico del 0,5%, gota a gota, en las macetas de yeso que contienen los embriones inyectados para limitar la contaminación fúngica. La liberación de citoplasma de embriones dañados durante el proceso de inyección es particularmente favorable para el crecimiento fúngico.</li>
	<li>Revise las macetas de yeso todos los días y retire cualquier embrión malo o muerto. Si el hongo está presente, retire todos los embriones infectados y agregue unas gotas de ácido propionico al 0,5%.</li>
	<li>Las larvas eclosionan entre el día 8 y 12 después de la inyección. Dos veces al día, transfiera las larvas recién emergidas a nuevas macetas de yeso, en grupos de máximo de 5-10. Agregue una pequeña cantidad de comida y revise la comida 2-3 veces a la semana.<ol>
<li>Controle cuidadosamente la cantidad de alimentos larvarios, ya que aumenta demasiado el riesgo de contaminación fúngica. Las larvas de mosca de arena sobreviven mejor en grupos, sin embargo, pueden ser caníbales si no hay suficiente comida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuando las larvas pupen, separe por sexo para mantener a las hembras como vírgenes. Si hay muchos sobrevivientes, deseche a los machos y mantenga sólo a las hembras. NOTA: Tanto los machos como las hembras pueden llevar y transmitir mutaciones. Sin embargo, como las hembras tienen que ser mantenidas vírgenes antes de que se crucen, es más fácil utilizar sólo las hembras inyectadas G0 para evitar tener que separar insectos wt por sexo. Los machos G0 se pueden mantener como refuerzo si el número de sobrevivientes adultos es bajo y en este caso serán apareados con hembras vírgenes wt ordenadas.</li>
</ol>5. Selección y cribado de alelos mutantes (Figura 5)
<ol><li>Cruza en masa a las hembras G0 con machos wt en una jaula. Ensangrente por completo, como se haría para el mantenimiento normal de colonias.</li>
	<li>Un día después de la alimentación en sangre, transfiera cada hembra G0 con machos de 2-3 wt en tubos de yeso individuales usando un aspirador bucal. Alimente las moscas con azúcar en una pequeña bola de algodón cambiada todos los días y use una jeringa de agua para asegurarse de que la humedad del yeso es adecuada para la puesta de huevos.</li>
	<li>Después de que las hembras G0 hayan puesto huevos (correspondientes a G1),recojan sus cuerpos en tubos Eppendorf individuales y anotados para genotipados posteriores. Mantener los embriones como se suele hacer para las colonias wt.</li>
	<li>Extraiga el ADN de las hembras G0 por el método de elección.</li>
	<li>Examine el ADN en busca de la presencia de mutaciones, por ejemplo diseñando un ensayo de PCR utilizando imprimaciones que rodean la región de los cortes CRISPR esperados.</li>
	<li>Mantenga sólo los embriones G1 colocados por las hembras G0 mostrando evidencia de transformación. Cuando estos embriones G1 se conviertan en pupas, separe por sexo y mantenga sólo a las hembras. Cruzar las hembras G1 de la misma hembra G0 a los machos wt, alimentarlos de sangre, luego transferir en pequeños grupos de 2-3 hembras y 4-5 machos en recipientes de tamaño pequeño. NOTA: Todos los individuos G1 tienen la oportunidad de llevar una mutación única, por lo que si el número de individuos sobrevivientes no es demasiado alto, entonces es mejor cruzar a las hembras G1 individualmente con machos wt. El caso de varias hembras portadoras de una mutación diferente presente en un mismo tubo es raro, pero puede ocurrir. Si tal caso se observa después del genotipado, las hembras progenies G2 deben aparearse individualmente a los machos wt. Este esquema de apareamiento evita la posibilidad de múltiples mutaciones en la progenie.</li>
	<li>Después de la puesta de huevos, recoger los cuerpos femeninos G1 y examinarlos en busca de mutaciones. Mantenga sólo los tubos donde al menos una hembra mostró evidencia de mutación.</li>
	<li>Para las generaciones posteriores, haga un solo par en cruces. Después de la puesta de huevos, examine a los padres en busca de presencia de mutación. Repita en cada generación hasta que ambos padres sean homocigóidos por la misma mutación. Una vez identificados, serán los fundadores de un stock mutante homocigógio.</li>
</ol>

<ol>
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Presentamos aquí un método de microinjección embrionaria recientemente desarrollado para la mutagénesis dirigida por CRISPR/Cas9 en moscas de arena Phlebotomus papatasi. La microinyección embrionaria para la modificación genética de insectos se desarrolló en Drosophila a mediados de la década de 198021 y ahora se utiliza rutinariamente en una amplia variedad de insectos. Se han desarrollado otros métodos para la entrega de materiales de modificación genética para su u...

Las enfermedades transmitidas por vectores son una de las principales amenazas para la salud pública en la evolución constante. Cientos de especies vectoriales repartidas entre familias filogengénicas muy distintas (por ejemplo, mosquitos, garrapatas, pulgas) son responsables de la transmisión de un gran número de patógenos microbianos, lo que resulta en más de 700.000 muertes humanas al año, según la Organización Mundial de la Salud. Entre los insectos vectoriales, las moscas de arena de fenbotomina (Diptera, Psicodidae) constituyen un vasto grupo, con 80 especies vectoriales probadas que exhiben rasgos fenotípicos distintos y capacidades vectoriales que se encuentran en diferentes regiones geográficas. Son vectores para los parásitos protozoicos del género Leishmania,causando alrededor de 1,3 millones de nuevos casos de Leishmaniases y entre 20.000 y 30.000 muertes al año. Los resultados clínicos de leishmaniases son diversos, con síntomas que van desde lesiones cutáneas autolimitantes hasta difusión visceral que es fatal en ausencia de tratamiento.
Las moscas de arena son insectos estrictamente terrestres. Su ciclo de vida, relativamente largo en comparación con otros Diptera, dura hasta tres meses, dependiendo de diferentes parámetros como la temperatura, la humedad y la nutrición. Consta de una etapa embrionaria (6 a 11 días), cuatro etapas larvarias (con una duración total de 23 a 25 días) y una etapa pupal (9 a 10 días) seguida de metamorfosis y luego la edad adulta. Las moscas de la arena requieren un ambiente húmedo y cálido para la cría. Tanto los machos como las hembras se alimentan de azúcares, obtenidos en la naturaleza a partir de néctares de flores. Sólo las hembras son alimentadoras de sangre, ya que requieren proteínas obtenidas de la harina de sangre para la producción de huevos1.
Un enfoque importante de la investigación es identificar la naturaleza de las interacciones vectoriales/parásitos que conducen al desarrollo de infecciones transmisibles. Al igual que con otros insectos vectoriales, se ha demostrado que los parámetros intrínsecos a las moscas de arena afectan su competencia vectorial, que se define como su capacidad para transportar y transmitir patógenos a sus huéspedes. Por ejemplo, la expresión de galectinas por el Phlebotomus papatasi sand fly midgut cells, actuando como receptores que reconocen componentes de la superficie del parásito, puede influir directamente en su competencia vectorial para Leishmania major2,3. La vía de respuesta inmune de insectos, Inmunodeficiencia (IMD), también es crucial para la competencia vectorial de mosca de arena Phlebotomus papatasi para Leishmania major4. Un papel crítico para las vías de respuesta inmune de insectos vectoriales en el control de su transmisión de patógenos infecciosos se ha notificado de manera similar en los mosquitos Aedes aegypti 5,6,7, en la mosca de la tsetse Glossina morsitans8,y en Anopheles gambiae mosquitos9,10.
Los estudios de las interacciones entre mosca de la arena/Leishmania se han visto limitados por la falta de métodos de modificación de la expresión génica adaptados para su uso en estos insectos. Sólo se había realizado la regulación de la bajada genética por ARN de interferencia pequeña (SIRNA)11,12,13,14 hasta hace poco. La técnica, limitada por la mortalidad asociada con la microinyección de las hembras adultas, conduce sólo a una pérdida parcial de la función, que no puede transmitirse de generación en generación.
La tecnología CRISPR/Cas9 ha revolucionado la investigación genómica funcional en organismos no modelo como las moscas de arena. Modificado desde el sistema inmune adaptativo en prokaryotes para la defensa contra bacteriófagos15,16, el sistema CRISPR Cas9 se ha adaptado rápidamente como una herramienta de edición del genoma para organismos eucariotas superiores, incluyendo insectos. El principio de la edición del genoma objetivo CRISPR/Cas9 se basa en la complementariedad de un ARN guía único (sgRNA) a un locus genómico específico. La nucleasa Cas9 se une al sgRNA y crea una rotura de ADN de doble hebra (dsDNA) en el ADN genómico donde el esgRNA se asocia con su secuencia complementaria. El complejo Cas9-sgRNA se guía a la secuencia de destino por 17 a 20 bases complementarias en el sgRNA al locus elegido, la rotura dsDNA puede ser reparada por dos vías independientes: unión final nohomóloga (NHEJ) o reparación dirigida por homología (HDR)17. La reparación de NHEJ implica un cierre simple de la rotura, pero con frecuencia conduce a pequeños eventos de inserción/eliminación. La reparación del ADN a través de HDR utiliza una molécula de ADN de donante que comparte la homología con el ADN objetivo como una plantilla para su reparación. Los insectos poseen ambas máquinas.
La tecnología CRISPR/Cas9 puede generar mutaciones en un locus elegido, a través de la vía de reparación del NHEJ; o para estrategias de edición del genoma más complejas, como knock-ins o reporteros de expresión, a través de la vía HDR con una plantilla de donante adecuada. En moscas de arena, se generaron alelos mutantes nulos del factor de respuesta inmune Sabor a través de CRISPR mediado por NHEJ en Phlebotomus papatasi4. También se inyectaron embriones de mosca de arena en otro estudio con una mezcla CRISPR/Cas9 dirigida al gen que codifica el amarillo. Aún así, no se produjeron adultos portadores de la mutación18. Aquí describimos un método detallado de mosca de arena dirigida mutagénesis por CRISPR/Cas9 mediada por NHEJ, con un enfoque particular en la microinyección embrionaria, un paso crítico del protocolo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28342-012</td>
			<td>Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-543A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Base layer of the microinjection set up Figure 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect cage</td>
			<td>custom made or several commercial options</td>
			<td></td>
			<td>polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval food</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcaps 100 ml</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-1000</td>
			<td>Used to back fill microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth aspirator</td>
			<td>John W. Hock Company</td>
			<td>Model 612</td>
			<td>mouth aspirator with HEPA filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX12</td>
			<td>Olympus Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovipots</td>
			<td>Nalge company</td>
			<td></td>
			<td>ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brush 6-0</td>
			<td>Any Art Supply Company</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used for aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402907</td>
			<td>antifungal agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td>Used for making microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection Controller and Micromanipulator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis

Las moscas de la arena son los vectores naturales de las especies de Leishmania, parásitos protozoos que producen un amplio espectro de síntomas que van desde lesiones cutáneas hasta patología visceral. Descifrar la naturaleza de las interacciones vectoriales/parásitos es de importancia primordial para una mejor comprensión de la transmisión de Leishmania a sus huéspedes. Entre los parámetros que controlan la competencia de vectores de mosca de arena (es decir, su capacidad para transportar y transmitir patógenos), se demostró que los parámetros intrínsecos a estos insectos desempeñaban un papel clave. La respuesta inmune de los insectos, por ejemplo, afecta la competencia de vectores de mosca de arena a Leishmania. El estudio de estos parámetros se ha visto limitado por la falta de métodos de modificación de la expresión génica adaptados para su uso en estos organismos no modelo. La regulación genética por ARN de interferencia pequeña (SIRNA) es posible, pero además de ser técnicamente desafiante, el silenciamiento conduce a sólo una pérdida parcial de la función, que no se puede transmitir de generación en generación. La mutagénesis dirigida por la tecnología CRISPR/Cas9 fue recientemente adaptada a la mosca de arena Phlebotomus papatasi. Esta técnica conduce a la generación de mutaciones transmisibles en un locus elegido específicamente, lo que permite estudiar los genes de interés. El sistema CRISPR/Cas9 se basa en la inducción de roturas de ADN de doble hebra dirigidas, posteriormente reparadas por la Unión Final No Homologosa (NHEJ) o por la Reparación Impulsada por Homología (HDR). NHEJ consiste en un cierre simple de la rotura y con frecuencia conduce a pequeños eventos de inserción / eliminación. Por el contrario, HDR utiliza la presencia de una molécula de ADN donante que comparte homología con el ADN objetivo como una plantilla para su reparación. Aquí, presentamos un método de microinyección de embriones de mosca de arena para la mutagénesis dirigida por CRISPR/Cas9 utilizando NHEJ, que es la única técnica de modificación del genoma adaptada a los vectores de mosca de arena hasta la fecha.

El protocolo de microinyección CRISPR/Cas9 descrito aquí para generar mutantes de mosca de arena se estableció en una publicación anterior4. Este enfoque produjo mutagénesis altamente eficiente, ya que 11 de cada 540 individuos sobrevivieron al procedimiento, de los cuales 9 fueron mutantes. Al diseñar guías para la mutación CRISPR/Cas9, un primer paso crítico es secuenciar la región alrededor del área a la que se va a dirigir. La plantilla para la secuenciación debe ser de la cepa que...

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Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Este protocolo detalla los pasos de crispr/cas9 mutagénesis dirigida en moscas de arena: recolección de embriones, inyección, cría de insectos e identificación, así como selección de mutaciones de interés.

Mosca de arena (Phlebotomus papatasi) Microinjeción embrionaria para CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

7.0K vistas.  National Institutes of Health. Este protocolo detalla los pasos de crispr/cas9 mutagénesis dirigida en moscas de arena: recolección de embriones, inyección, cría de insectos e identificación, así como selección de mutaciones de interés.

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Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the African clawed frog, Xenopus, a longstanding model organism for biomedical research. Traditional breeding schemes for creating homozygous mutant lines with CRISPR/Cas9-targeted mutagenesis have several time-consuming and laborious steps. To facilitate the creation of mutant embryos, particularly to overcome the obstacles associated with knocking out genes that are essential for embryogenesis, a new method called leapfrogging was developed. This technique leverages the robustness of Xenopus embryos to &#34;cut and paste&#34; embryological methods. Leapfrogging utilizes the transfer of primordial germ cells (PGCs) from efficiently-mutagenized donor embryos into PGC-ablated wildtype siblings. This method allows for the efficient mutation of essential genes by creating chimeric animals with wildtype somatic cells that carry a mutant germline. When two F0 animals carrying &#34;leapfrog transplants&#34; (i.e., mutant germ cells) are intercrossed, they produce homozygous, or compound heterozygous, null F1 embryos, thus saving a full generation time to obtain phenotypic data. Leapfrogging also provides a new approach for analyzing maternal effect genes, which are refractory to F0 phenotypic analysis following CRISPR/Cas9 mutagenesis. This manuscript details the method of leapfrogging, with special emphasis on how to successfully perform PGC transplantation.

Primordial Germ Cell Transplantation for CRISPR/Cas9-based Leapfrogging in Xenopus

Genes essential for survival pose technical hurdles for creating mutant lines. Leapfrogging circumvents lethality by combining genome editing with primordial germ cell transplantation to create wild-type animals carrying germline mutations. Leapfrogging also permits the efficient generation of homozygous null mutants in the F1 generation. Here, the transplantation step is demonstrated.

Trasplante de células de germen primordiales para basada en CRISPR/Cas9 Leapfrogging en Xenopus

The creation of mutant lines by genome editing is accelerating genetic analysis in many organisms. CRISPR/Cas9 methods have been adapted for use in the ...

Investigación

Genética

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration of transgenes. However, due to the low efficiency of homologous recombination (HR) and various indel mutations of non-homologous end joining (NHEJ)-based strategies in non-dividing cells, in vivo genome editing remains a great challenge. Here, we describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based CRISPR/Cas9 system for efficient in vivo precise targeted integration. In this system, the targeted genome and the donor vector containing homology arms (~800 bp) flanked by single guide RNA (sgRNA) target sequences are cleaved by CRISPR/Cas9. This HMEJ-based strategy achieves efficient transgene integration in mouse zygotes, as well as in hepatocytes in vivo. Moreover, a HMEJ-based strategy offers an efficient approach for correction of fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) mutation in the hepatocytes and rescues Fah-deficiency induced liver failure mice. Taken together, focusing on targeted integration, this HMEJ-based strategy provides a promising tool for a variety of applications, including generation of genetically modified animal models and targeted gene therapies.

CRISPR/Cas9-mediated Targeted Integration In Vivo Using a Homology-mediated End Joining-based Strategy

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system provides a promising tool for genetic engineering, and opens up the possibility of targeted integration of transgenes. We describe a homology-mediated end joining (HMEJ)-based strategy for efficient DNA targeted integration in vivo and targeted gene therapies using CRISPR/Cas9.

Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología

As a promising genome editing platform, the CRISPR/Cas9 system has great potential for efficient genetic manipulation, especially for targeted integration ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinyección de embriones y la técnica de trasplante para la manipulación del genoma de Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or C-terminal fluorescent tags. The prokaryotic CRISPR/Cas9 system (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9) may be used to introduce large exogenous sequences into genomic loci via homology directed repair (HDR). To achieve the desired knock-in, this protocol employs the ribonucleoprotein (RNP)-based approach where wild type Streptococcus pyogenes Cas9 protein, synthetic 2-part guide RNA (gRNA), and a donor template plasmid are delivered to the cells via electroporation. Putatively edited cells expressing the fluorescently tagged proteins are enriched by fluorescence activated cell sorting (FACS). Clonal lines are then generated and can be analyzed for precise editing outcomes. By introducing the fluorescent tag at the genomic locus of the gene of interest, the resulting subcellular localization and dynamics of the fusion protein can be studied under endogenous regulatory control, a key improvement over conventional overexpression systems. The use of hiPSCs as a model system for gene tagging provides the opportunity to study the tagged proteins in diploid, nontransformed cells. Since hiPSCs can be differentiated into multiple cell types, this approach provides the opportunity to create and study tagged proteins in a variety of isogenic cellular contexts.

Described here is a protocol for tagging endogenously expressed proteins with fluorescent tags in human induced pluripotent stem cells using CRISPR/Cas9. Putatively edited cells are enriched by fluorescence activated cell sorting and clonal cell lines are generated.

Proteína endógena Tagging en humanos inducida por células madre pluripotentes utilizando CRISPR/Cas9

A protocol is presented for generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) that express endogenous proteins fused to in-frame&#160;N- or ...

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-mediated Precise Gene Editing by Tube Electroporation

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of CRISPR/Cas9 elements into the target cells by transfection is a prerequisite for efficient gene editing. This protocol demonstrates that tube electroporation (TE) machine-mediated delivery of CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein (RNP), along with single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor templates to different types of mammalian cells, leads to robust precise gene editing events. First, TE was applied to deliver CRISPR/Cas9 RNP and ssODNs to induce disease-causing mutations in the interleukin 2 receptor subunit gamma (IL2RG) gene and sepiapterin reductase (SPR) gene in rabbit fibroblast cells. Precise mutation rates of 3.57%-20% were achieved as determined by bacterial TA cloning sequencing. The same strategy was then used in human iPSCs on several clinically relevant genes including epidermal growth factor receptor (EGFR), myosin binding protein C, cardiac (Mybpc3), and hemoglobin subunit beta (HBB). Consistently, highly precise mutation rates were achieved (11.65%-37.92%) as determined by deep sequencing (DeepSeq). The present work demonstrates that tube electroporation of CRISPR/Cas9 RNP represents an efficient transfection protocol for gene editing in mammalian cells.

Presented here is a protocol for efficient CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-mediated gene editing in mammalian cells using tube electroporation.

CRISPR/Cas9 Edición génica precisa mediada por Ribonucleoproteína por electroporación de tubo

Gene editing nucleases, represented by CRISPR-associated protein 9 (Cas9), are becoming mainstream tools in biomedical research. Successful delivery of ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species alike. This technology can be used for a variety of genome editing approaches, from gene knockouts and knockins to more specific changes like the introduction of a few nucleotides at a targeted location. Genome editing can be used for a multitude of applications, including the partial functional characterization of genes, the production of transgenic organisms and the development of diagnostic tools. Compared to previously available gene editing strategies, the CRISPR-Cas9 system has been shown to be easy to establish in new species and boasts high efficiency and specificity. The primary reason for this is that the editing tool uses an RNA molecule to target the gene or sequence of interest, making target molecule design straightforward, given that standard base pairing rules can be exploited. Similar to other genome editing systems, CRISPR-Cas9-based methods also require efficient and effective transformation protocols as well as access to good quality sequence data for the design of the targeting RNA and DNA molecules. Since the introduction of this system in 2013, it has been used to genetically engineer a variety of model species, including Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster and Mus musculus. Subsequently, researchers working on non-model species have taken advantage of the system and used it for the study of genes involved in processes as diverse as secondary metabolism in fungi, nematode growth and disease resistance in plants, among many others. This protocol detailed below describes the use of the CRISPR-Cas9 genome editing protocol for the truncation of a gene involved in the sexual cycle of Huntiella omanensis, a filamentous ascomycete fungus belonging to the Ceratocystidaceae family.

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is an easy-to-use genome editor that has been used in model and non-model species. Here we present a protein-based version of this system that was used to introduce a premature stop codon into a mating gene of a non-model filamentous ascomycete fungus.

Edición del genoma mediado por CRISPR-Cas9 en el Ascomicete Filamentoso Huntiella omanensis

The CRISPR-Cas9 genome editing system is a molecular tool that can be used to introduce precise changes into the genomes of model and non-model species ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Inyecciones de embriones para la mutagénesis mediada por CRISPR en el saltador de la hormiga Harpegnathos

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...