Name: sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis
Uploaded: 2020-11-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis at JoVE.com

Os autores agradecem a Vanessa Meldener-Harrell pela leitura crítica do manuscrito.

O uso de camundongos como fonte de sangue para alimentação de moscas de areia foi realizado de acordo com as recomendações do Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH). O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do NIAID, NIH (número de protocolo LPD 68E). Os invertebrados não estão cobertos pelas diretrizes do NIH.
1. Preparação da agulha(Figura 1)
<ol><li>Puxe agulhas e bisel como descrito em Meuti e Harrell19. Brevemente, puxe agulhas em um puxador de micropipette de vidro de dois estágios, usando capilares de vidro borossilicato.</li>
	<li>Afie as agulhas molhadas no beveller de micropipette, usando uma pedra extra fina.</li>
</ol>2. Coleta e micromanipulação de embriões (Figura 2)
<ol><li>Cinco dias antes do dia da injeção, a alimentação sanguínea e as fêmeas voam fêmeas como realizada rotineiramente para a manutenção da colônia. Para obter detalhes sobre as colônias de moscas de areia que criam procedimentos e material necessário, consulte Lawyer et al.1 Mantenha os insetos em incubadoras com 70% de umidade e 26 °C, durante todo o seu desenvolvimento.<ol>
<li>Um dia, após a alimentação sanguínea, capture fêmeas alimentadas com sangue por grupos de 100-150 em potes de gesso com uma porta lateral. Mantenha as fêmeas alimentando-as com solução de açúcar (30% de sacarose – volume suficiente para absorver uma pequena bola de algodão) o que é comum para a manutenção da colônia.</li>
	</ol>
</li>
	<li>No dia 2-3 pós alimentação sanguínea, NÃO umedeça os potes de gesso. Manter as fêmeas em um substrato seco evitará a colocação prematura de ovos, uma vez que as fêmeas preferem colocar ovos em um ambiente úmido.</li>
	<li>No dia 5 pós-alimentação sanguínea, realize a coleta de embriões, micromanipulação e microinjeção. Introduza um papel filtro úmido na câmara de colocação de ovos. Embriões recém-colocados não têm um acorde totalmente desenvolvido e parecem brancos. Use papel filtro preto durante o procedimento para facilitar a visualização dos embriões brancos.</li>
	<li>Transfira um pequeno grupo de fêmeas da panela de gesso para a câmara de colocação de ovos através das portas laterais usando um aspirador bucal. A presença de um substrato úmido (o papel filtro) induz as fêmeas a oviposit.</li>
	<li>Depois de 30-60 min, recupere cuidadosamente o papel filtro com embriões recém-colocados da câmara. Mantenha o papel filtro e os embriões em uma placa de Petri por até 3 horas. Durante este tempo, avalie regularmente o nível de umidade do papel filtro para garantir que ele permaneça úmido. Durante esse período, repita as etapas 2.4 a 2.6 com novos grupos de fêmeas e colete o maior número possível de embriões.</li>
	<li>Prepare slides de microscópio para a injeção: colete manualmente os ovos um a um com um pincel muito fino e transfira-os cuidadosamente para outro pedaço de papel filtro preto úmido colocado em um slide de microscópio coberto com uma mancha de vidro.<ol>
<li>Adicione água ao papel filtro, o suficiente para manter os embriões úmidos, mas não fazendo com que flutuem para longe da tampa ou sejam sugados sob a tampa. Alinhe os embriões contra o deslizamento. O deslizamento de cobertura age como um backstop impedindo que os ovos se afastem durante a injeção.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Injeções de Embriões(Figura 3)
<ol><li>Iniciar injeções de 2,5 a 3 horas após o início da coleta de ovos. Realizar injeções à temperatura ambiente e umidade do laboratório ambiente.</li>
	<li>Certifique-se de que os embriões alinhados tenham água suficiente para que sejam mantidos úmidos. NOTA: É fundamental que os embriões sejam mantidos úmidos durante as injeções. Se não estiverem úmidos durante o processo de injeção, as injeções se tornam difíceis porque a agulha tem problemas para perfurar o embrião. A quantidade correta de água é o ponto em que os embriões têm um menisco de água ao seu redor, mas o deslizamento não está flutuando em cima da água fazendo com que os embriões empurrem sob o deslizamento de cobertura. É fundamental monitorar a quantidade de água ao redor dos embriões durante as injeções. Adicione água conforme necessário para manter os embriões úmidos.</li>
	<li>Adicione a água cuidadosamente, molhando uma escova com água e transferindo a água para a parte de trás do papel do filtro. Adicionar água desta forma permite que a água seja adicionada de forma lenta e controlada para que apenas o suficiente seja adicionado para manter os embriões úmidos. Muita água pode fazer com que os embriões flutuem para fora do alinhamento, dificultando a injeção dos embriões.</li>
	<li>Misture a injeção de carga na agulha de microinjeção. Adicione aproximadamente 0,5 a 1 μL de mistura de injeção na agulha usando um enchimento de agulha borossilicato desenhado à mão, as pontas de tubulação de carregamento de gel também podem ser usadas. A mistura de injeção é composta de um ou vários RNA guia (80 ng/μL cada) projetado para atingir um lócus específico misturado com proteína Cas9 recombinante comercial (300 ng/μL).</li>
	<li>Começando com a pressão de injeção a 30 psi, pressione o gatilho de injeção para expulsar o ar da ponta da agulha. Isso forçará a mistura de injeção à ponta da agulha permitindo que a mistura de injeção flua. Neste ponto, aumente lentamente a pressão de espera/constante até que o material de injeção comece a fluir, em seguida, recue a pressão de espera/constante para que ele fique logo abaixo do ponto da mistura de injeção que flui da agulha. O ambiente fechado deve fornecer apenas material de injeção suficiente para que uma pequena quantidade de material possa ser vista para entrar no embrião. NOTA: A injeção de embriões de mosca de areia sob óleo de halocarbono semelhante a outros protocolos usados para Drosophila e mosquitos foi inicialmente testada, porém a porcentagem de sobrevivência dessas injeções foi muito baixa. A sobrevivência foi melhorada com a mudança para injeções em papel filtro úmido como descrito acima.</li>
	<li>Insira a agulha na lateral do embrião. Use o deslizamento atrás do embrião como um backstop que ajudará a agulha a perfurar o embrião. Entregue uma pequena quantidade de mistura de injeção no embrião antes de remover suavemente a agulha.</li>
	<li>Imediatamente após a remoção da agulha, pressione o injetor para remover qualquer material reabastecado da ponta da agulha. Isso ajudará a evitar que a agulha entupisse.</li>
	<li>Vá para o próximo embrião. Entre cada injeção, certifique-se de que o papel do filtro está úmido e que a agulha não está entupida.</li>
	<li>Uma vez que todos os embriões tenham sido injetados, conte o número de embriões injetados para manter uma contagem de execução.</li>
	<li>Remova a mancha de cobertura adicionando água ao papel do filtro para que a mancha de cobertura flutue. Neste ponto, use uma sonda (vara aplicadora de madeira com pino de inseto colado na ponta) para manter o papel filtro no lugar enquanto um dedo é usado para puxar a tampa para longe dos embriões injetados.</li>
	<li>Limpe o excesso de água do papel do filtro uma vez que a mancha de cobertura tenha sido removida.</li>
</ol>4. Criação pós-injeção (G0)(Figura 4)
<ol><li>Transfira o papel filtro com os embriões em cima de várias camadas de papel filtro úmido colocado em uma placa de Petri para manter a umidade. Mantenha os embriões aqui durante o tempo necessário para injetar outros embriões. Embriões podem ser mantidos por um máximo de 3 horas como este. Após a injeção, eles vão lentamente ficar marrons.</li>
	<li>Uma vez que todos os embriões tenham sido injetados, transfira manualmente-os para potes de gesso de pequeno porte previamente umedecidos. Não coloque muitos embriões em cada pote e mantenha distância entre eles, para evitar uma possível contaminação fúngica entre os indivíduos. Cubra os potes com uma tela e armazene-os como normalmente seria feito para ovos de colônia de moscas de areia, mantidos em incubadoras a 70% de umidade e 26 °C, durante todo o seu desenvolvimento.</li>
	<li>No primeiro dia pós-injeção, remova todos os embriões danificados e mortos com um pincel. Adicione 100 μL de ácido propiônico de 0,5%, gota a gota, nos potes de gesso contendo os embriões injetados para limitar a contaminação fúngica. A liberação de citoplasma de embriões danificados durante o processo de injeção é particularmente favorável ao crescimento fúngico.</li>
	<li>Verifique os potes de gesso todos os dias e remova os embriões ruins ou mortos. Se o fungo estiver presente, remova todos os embriões infectados e adicione algumas gotas de ácido propiônico de 0,5%.</li>
	<li>Larvas eclodem entre os dias 8 e 12 pós-injeção. Duas vezes por dia, transfira as larvas recém-emergidas para novos potes de gesso, em grupos de 5-10 no máximo. Adicione uma pequena quantidade de comida e verifique a comida 2-3 vezes por semana.<ol>
<li>Monitore cuidadosamente a quantidade de alimentos larvais, pois aumenta muito o risco de contaminação fúngica. Larvas de mosca de areia sobrevivem melhor em grupos, porém podem ser canibais se não houver comida suficiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quando as larvas pupar, separe-as por sexo para manter as fêmeas como virgens. Se houver muitos sobreviventes, descarte os machos e mantenha apenas as fêmeas. NOTA: Tanto os machos quanto as fêmeas podem carregar e transmitir mutações. No entanto, como as fêmeas têm que ser mantidas virgens antes de serem cruzadas, é mais fácil usar apenas as fêmeas injetadas do G0 para evitar ter que separar os insetos wt por sexo. Os machos G0 podem ser mantidos como reforço se o número de sobreviventes adultos for baixo e, neste caso, será acasalado com fêmeas virgens classificadas.</li>
</ol>5. Seleção e triagem de alelos mutantes(Figura 5)
<ol><li>Cruze em massa as fêmeas G0 com machos em uma gaiola. Alimenta-os completamente, como seria feito para a manutenção normal da colônia.</li>
	<li>Um dia, após a alimentação sanguínea, transfira cada fêmea G0 com machos de 2-3 wt em tubos individuais de gesso usando um aspirador bucal. Alimente as moscas com açúcar em uma pequena bola de algodão trocada todos os dias e use uma seringa de água para garantir que a umidade do gesso seja adequada para a colocação de ovos.</li>
	<li>Após as fêmeas G0 colocarem ovos (correspondentes ao G1),recolher seus corpos em tubos Eppendorf anotados para genotipagem posterior. Mantenha os embriões como normalmente feito para colônias wt.</li>
	<li>Extrair o DNA das fêmeas G0 pelo método de escolha.</li>
	<li>Trie o DNA para a presença de mutações, por exemplo, projetando um ensaio pcr usando primers em torno da região de cortes crocantes esperados.</li>
	<li>Mantenha apenas os embriões G1 colocados por fêmeas G0 mostrando evidências de transformação. Quando esses embriões G1 se desenvolverem em pupas, separem-nos pelo sexo e mantenham apenas as fêmeas. Cruze as fêmeas G1 do mesmo sexo feminino G0 para os machos, alimenta-os com sangue, depois transfira em pequenos grupos de 2-3 fêmeas e 4-5 machos em recipientes de pequeno porte. NOTA: Todos os indivíduos do G1 têm a chance de carregar uma mutação única, portanto, se o número de indivíduos sobreviventes não é muito alto, então é melhor cruzar as fêmeas G1 individualmente com os machos wt. O caso de várias fêmeas carregando uma mutação diferente presente em um mesmo tubo é raro, mas pode ocorrer. Se esse caso for observado após a genotipagem, as fêmeas progêneras G2 devem então ser acasaladas individualmente para os machos wt. Este esquema de acasalamento evita a possibilidade de múltiplas mutações na prole.</li>
	<li>Após a colocação de ovos, colete os corpos femininos G1 e trie-os para mutações. Mantenha apenas os tubos onde pelo menos uma fêmea mostrou evidência de mutação.</li>
	<li>Para gerações posteriores fazer um par único em cruzes. Depois da colocação de ovos, pais de tela para a presença de mutação. Repita em cada geração até que ambos os pais sejam homozigosos para a mesma mutação. Uma vez identificados, eles serão os fundadores de um estoque mutante homozigoso.</li>
</ol>

<ol>
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Apresentamos aqui um método de microinjeção de embriões recentemente desenvolvido para mutagênese direcionada por CRISPR/Cas9 em moscas de areia Phlebotomus papatasi. A microinjeção de embriões para modificação genética de insetos foi desenvolvida em Drosophila em meados da década de 198021 e agora é usada rotineiramente em uma grande variedade de insetos. Outros métodos para a entrega de materiais de modificação genética foram desenvolvidos para uso em insetos, ...

As doenças transmitidas por vetores são uma grande ameaça à saúde pública em constante evolução. Centenas de espécies vetoriais espalhadas por famílias filogênicas muito distintas (por exemplo, mosquitos, carrapatos, pulgas) são responsáveis pela transmissão de um grande número de patógenos microbianos, resultando em mais de 700.000 mortes humanas por ano, de acordo com a Organização Mundial da Saúde. Entre os insetos vetoriais, as moscas de areia de flebotomina (Diptera, Psychodidae) constituem um vasto grupo, com 80 espécies vetoriais comprovadas exibindo traços fenotípicos distintos e capacidades vetoriais encontradas em diferentes regiões geográficas. São vetores para os parasitas protozoários do gênero Leishmania,causando cerca de 1,3 milhão de novos casos de Leishmanioses e entre 20.000 e 30.000 mortes por ano. Os desfechos clínicos das leishmanioses são diversos, com sintomas que vão desde lesões cutâneas auto-limitantes até disseminação visceral que é fatal na ausência de tratamento.
Moscas de areia são insetos estritamente terrestres. Seu ciclo de vida, relativamente longo em comparação com outros Diptera, dura até três meses, dependendo de diferentes parâmetros, como temperatura, umidade e nutrição. Consiste em um estágio embrionário (6 a 11 dias), quatro estágios larvais (com duração total de 23 a 25 dias) e um estágio pupal (9 a 10 dias) seguido de metamorfose e depois idade adulta. Moscas de areia requerem um ambiente úmido e quente para a criação. Tanto machos quanto fêmeas se alimentam de açúcares, obtidos na natureza a partir de néctars de flores. Apenas as fêmeas são alimentadores de sangue, pois necessitam de proteínas obtidas da farinha de sangue para a produção de ovos1.
Um foco importante da pesquisa é identificar a natureza das interações vetor/parasita que levam ao desenvolvimento de infecções transmissíveis. Assim como outros insetos vetoriais, parâmetros intrínsecos às moscas de areia têm mostrado impacto em sua competência vetorial, que é definida como sua capacidade de transportar e transmitir patógenos para seus hospedeiros. Por exemplo, a expressão de galectinas pelos phlebotomus papatasi e células midgut de mosca, agindo como receptores reconhecendo componentes da superfície parasita, pode influenciar diretamente sua competência vetorial para Leishmania maior2,3. A via de resposta imune ao inseto, Immune Deficiency (IMD), também é crucial para a competência vetorial de phlebotomus papatasi para a Leishmania maior4. Um papel crítico para as vias de resposta imune a insetos vetoriais no controle de sua transmissão de patógenos infecciosos tem sido relatado da mesma forma nos mosquitos Aedes aegypti 5,6,7, na mosca tsé-tsé Glossina morsitans8, e em Anopheles gárdias mosquitos 9,10.
Estudos de interações de moscas deareia/Leishmania têm sido limitados pela falta de métodos de modificação da expressão genética adaptados para uso nesses insetos. Apenas a desregulamentação genética por RNA de pequena interferência (siRNA) havia sido realizada11,12,13,14 até recentemente. A técnica, limitada pela mortalidade associada à microinjeção de fêmeas adultas, leva apenas a uma perda parcial de função, que não pode ser transmitida de geração em geração.
A tecnologia CRISPR/Cas9 revolucionou a pesquisa genômica funcional em organismos não-modelo, como moscas de areia. Modificado do sistema imunológico adaptativo em procariotes para defesa contra bacteriófagos15,16, o sistema CRISPR Cas9 foi rapidamente adaptado como uma ferramenta de edição de genomas para organismos eucarióticos superiores, incluindo insetos. O princípio da edição de genoma direcionada do CRISPR/Cas9 baseia-se na complementaridade de um único guia RNA (sgRNA) a um lócus genômico específico. A nuclease Cas9 se liga ao sgRNA e cria uma quebra de DNA de duas vertentes (dsDNA) no DNA genômico onde o sgRNA se associa à sua sequência complementar. O complexo Cas9-sgRNA é guiado à sequência de destino por 17 a 20 bases complementares no sgRNA para o lócus escolhido, o rompimento dsDNA pode então ser reparado por duas vias independentes: junção final nonhomologous (NHEJ) ou reparo direcionado à homologia (HDR)17. O reparo do NHEJ envolve um simples fechamento do intervalo, mas frequentemente leva a pequenos eventos de inserção/exclusão. A reparação de DNA através do HDR usa uma molécula de DNA doador compartilhando a homologia com o DNA alvo como modelo para reparo. Insetos possuem ambas as máquinas.
A tecnologia CRISPR/Cas9 pode gerar mutações em um lócus escolhido, através da via de reparo NHEJ; ou para estratégias de edição de genomas mais complexas, como knock-ins ou repórteres de expressão, através da via HDR com um modelo de doador apropriado. Em moscas de areia, alelos mutantes nulos do fator de resposta imune Relish foram gerados através de CRISPR mediado por NHEJ em Phlebotomus papatasi4. Embriões de mosca de areia também foram injetados em outro estudo com uma mistura CRISPR/Cas9 visando a codificação genética Amarela. Ainda assim, nenhum adulto portador da mutação foi produzido18. Descrevemos aqui um método detalhado de mutagênese direcionada à mosca-da-areia pelo CRISPR/Cas9 mediado pela NHEJ, com um foco particular na microinjeção do embrião, um passo crítico do protocolo.

<table><tbody><tr><td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td><td>VWR</td><td>28342-012</td><td>Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-543A</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Any brand</td><td></td><td>For aligning embryos</td></tr><tr><td>Glass slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td>Base layer of the microinjection set up Figure 2A</td></tr><tr><td>Insect cage</td><td>custom made or several commercial options</td><td></td><td>polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &amp;ldquo;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&amp;rdquo; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Larval food</td><td>custom made</td><td></td><td>a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &amp;ldquo;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&amp;rdquo; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Microcaps 100 ml</td><td>Drummond</td><td>1-000-1000</td><td>Used to back fill microinjection needles</td></tr><tr><td>Mouth aspirator</td><td>John W. Hock Company</td><td>Model 612</td><td>mouth aspirator with HEPA filter</td></tr><tr><td>Olympus SZX12</td><td>Olympus Life Sciences</td><td></td><td>Microinjection microscope</td></tr><tr><td>Ovipots</td><td>Nalge company</td><td></td><td>ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &amp;ldquo;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&amp;rdquo; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td></tr><tr><td>Paint Brush 6-0</td><td>Any Art Supply Company</td><td>n/a</td><td>Used for aligning embryos</td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td>antifungal agent</td></tr><tr><td>Standard Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-3</td><td>Used for making microinjection needles</td></tr><tr><td>Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Microinjection Controller and Micromanipulator</td></tr></tbody></table>

sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis

Moscas de areia são os vetores naturais da espécie Leishmania, parasitas protozoários produzindo um amplo espectro de sintomas que vão desde lesões cutâneas até patologia visceral. Decifrar a natureza das interações vetor/parasita é de importância primária para uma melhor compreensão da transmissão de Leishmania aos seus hospedeiros. Entre os parâmetros que controlam a competência vetorial da mosca de areia (ou seja, sua capacidade de transportar e transmitir patógenos), parâmetros intrínsecos a esses insetos mostraram-se um papel fundamental. A resposta imune a insetos, por exemplo, impacta a competência vetorial da mosca da areia para a Leishmania. O estudo desses parâmetros tem sido limitado pela falta de métodos de modificação da expressão genética adaptados para uso nesses organismos não-modelo. A baixa genética por RNA de pequena interferência (siRNA) é possível, mas além de ser tecnicamente desafiador, o silenciamento leva apenas a uma perda parcial de função, que não pode ser transmitida de geração em geração. Mutagênese direcionada pela tecnologia CRISPR/Cas9 foi recentemente adaptada para a mosca de areia Phlebotomus papatasi. Essa técnica leva à geração de mutações transmissíveis em um lócus especificamente escolhido, permitindo estudar os genes de interesse. O sistema CRISPR/Cas9 conta com a indução de quebras de DNA de dois fios direcionados, posteriormente reparados por NHEJ (Non-Homólogos End Joining) ou por Homology Driven Repair (HDR). O NHEJ consiste em um simples fechamento da quebra e frequentemente leva a pequenos eventos de inserção/exclusão. Em contraste, o HDR usa a presença de uma molécula de DNA doador compartilhando a homologia com o DNA alvo como modelo para reparo. Aqui, apresentamos um método de microinjeção de embriões de mosca de areia para mutagênese direcionada pelo CRISPR/Cas9 usando NHEJ, que é a única técnica de modificação do genoma adaptada aos vetores de mosca de areia até o momento.

O protocolo de microinjeção CRISPR/Cas9 descrito aqui para gerar mutantes de moscas de areia foi estabelecido em uma publicação anterior4. Essa abordagem produziu mutagênese altamente eficiente, já que 11 dos 540 indivíduos sobreviveram ao procedimento, dos quais 9 eram mutantes. Ao projetar guias para mutação CRISPR/Cas9, um primeiro passo crítico é sequenciar a região ao redor da área a ser alvo. O modelo para sequenciamento deve ser da cepa que será usada como fonte de embriões p...

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Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Este protocolo detalha as etapas da mutagênese direcionada do CRISPR/Cas9 em moscas de areia: coleta de embriões, injeção, criação de insetos e identificação, bem como seleção de mutações de interesse.

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

7.1K visualizações.  National Institutes of Health. Este protocolo detalha as etapas da mutagênese direcionada do CRISPR/Cas9 em moscas de areia: coleta de embriões, injeção, criação de insetos e identificação, bem como seleção de mutações de interesse.

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Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

Entrega de Ácidos Nucleicos através de microinjeção de embriões na Worldwide Agrícola praga de insectos,<em&gt; Ceratitis capitata</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Genética

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

Microinjeção de embrião e a técnica de transplante para manipulação de genoma Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

Técnicas de microinjeção de embriões para mutagênese específica do local eficiente em Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

Injeções embrionárias para mutagênese mediada por CRISPR no saltador de formigas Harpegnathos

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

FiC31 Transgênese embrionária mediada por integrase em Drosophila

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

Autor em destaque: Otimizando a microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

Edição do genoma no mosquito da febre amarela Aedes aegypti usando CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

Microinjeção de Embrião e Identificação Mutante Nocaute de NÍTIda/Cas9 Editado Genoma Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Comportamento

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to their successful evolutionary radiation on the earth. The application of genetic tools such as genome editing is the key to understanding genetic changes that are responsible for evolutionary transitions in an Evo-Devo approach. In this article, we describe our current protocol for generating and maintaining mutant strains of T. domestica. We report a dry injection method, as an alternative to the reported wet injection method, that allows us to obtain stably high survival rates in injected embryos. We also report an optimized environment setting to mate adults and obtain subsequent generations with high efficiency. Our method underlines the importance of taking each species&#8217; unique biology into account for the successful application of genome editing methods to non-traditional model organisms. We predict that these genome editing protocols will help in implementing T. domestica as a laboratory model and to further accelerate the development and application of useful genetic tools in this species.

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

We provide a detailed protocol for rearing, microinjection of eggs and for efficient mating of the firebrat Thermobia domestica to generate and maintain mutant strains after genome editing.

Microinjeção de Ovos e Acasalamento Eficiente para Edição de Genoma na Thermobia domestica firebrat

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Microinjeção de Embrião para Mutagenesis CRISPR/Cas9

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Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

Microinjeção de embriões para transgênese em Drosophila

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