המחברים מודים לוונסה מלדנר-הארל על הקריאה הביקורתית של כתב היד.

השימוש בעכברים כמקור דם להאכלת זבוב חול נעשה בהתאם להמלצות המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH). הפרוטוקול אושר על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של NIAID, NIH (מספר פרוטוקול LPD 68E). חסרי חוליות אינם מכוסים תחת הנחיות NIH.
1. הכנת מחט (איור 1)
<ol><li>משוך מחטים ושיפוע כמתואר ב Meuti והארל19. בקצרה, משוך מחטים על משיכת מיקרופיפט זכוכית דו-שלבית, באמצעות נימי זכוכית בורוסיליקט.</li>
	<li>לחדד את המחטים על ידי שיפוע רטוב על שיפוע micropipette, באמצעות אבן עדינה נוספת.</li>
</ol>2. אוסף עוברים ומיקרומניפולציה (איור 2)
<ol><li>חמישה ימים לפני יום ההזרקה, נקבות חול מאכילות דם עפות כפי שהן מבוצעות באופן שגרתי לתחזוקת המושבה. לפרטים על מושבות זבוב חול גידול נהלים וחומר נדרש, אנא עיין עו"ד ואח'1 לשמור על החרקים באינקובטורים ב 70% לחות ו 26 °C (60 °F), במהלך כל התפתחותם.<ol>
<li>יום אחד לאחר האכלת הדם, ללכוד נקבות שניזונו בדם על ידי קבוצות של 100-150 בסירי גבס עם נמל צדדי. לשמור על הנקבות על ידי האכלת אותם עם תמיסת סוכר (30% סוכרוז – נפח מספיק כדי להשרות כדור כותנה קטן) וזה הרגיל לתחזוקת המושבה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ביום 2-3 לאחר האכלת הדם, אין להרטיב את סירי הגבס. שמירה על הנקבות על מצע יבש תמנע הטלת ביצים מוקדמת, שכן הנקבות מעדיפות להטיל ביצים על סביבה לחה.</li>
	<li>ביום 5 לאחר האכלת הדם, לבצע את אוסף העובר, מיקרומניפולציה, microinjection. הכניסו נייר סינון לח לתא הטלת הביצים. לעוברים טריים אין כוריון מפותח לחלוטין והם נראים לבנים. השתמש בנייר סינון שחור במהלך ההליך כדי להקל על הדמיית העוברים הלבנים.</li>
	<li>מעבירים קבוצה קטנה של נקבות מסיר הגבס לתא הטלת הביצים דרך היציאות הצדדיות באמצעות שאיפת פה. נוכחותו של מצע לח (נייר הסינון) גורם לנקבות לביצית.</li>
	<li>לאחר 30-60 דקות, בזהירות לאחזר את נייר המסנן עם עוברים שהונחו לאחרונה מן התא. שומרים את נייר הסינון והעוברים בצלחת פטרי עד 3 שעות. במהלך תקופה זו, להעריך באופן קבוע את רמת הלחות של נייר המסנן כדי להבטיח שהוא נשאר לח. במהלך תקופה זו, לחזור על שלבים 2.4 כדי 2.6 עם קבוצות חדשות של נקבות ולאסוף עוברים רבים ככל האפשר.</li>
	<li>מכינים שקופיות מיקרוסקופ להזרקה: אוספים ידנית את הביצים אחת אחרי השנייה עם מברשת צבע עדינה מאוד ומעבירים אותן בזהירות לחתיכה אחרת של נייר סינון שחור לח שהונח על מגלשת מיקרוסקופ ומעליה כיסוי זכוכית.<ol>
<li>מוסיפים מים לנייר הסינון, מספיק כדי לשמור על העוברים לחים אך לא גורמים להם לצוף הרחק מהכיסוי או להישאב מתחת לכיסוי. תסדר את העוברים כנגד הכיסוי. העטיפה משמשת כפסע אחורי המונע מהביצים להתגלגל במהלך ההזרקה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. זריקות עוברים (איור 3)
<ol><li>התחל זריקות 2.5 עד 3 שעות לאחר תחילת איסוף הביצים. בצעו זריקות בטמפרטורת החדר ובלחות המעבדה הסביבתית.</li>
	<li>ודאו שלעוברים המיושרים יש מספיק מים כדי שהם יישמרו לחים. הערה: זה קריטי כי העוברים נשמרים לחים במהלך הזריקות. אם הם לא לחים במהלך תהליך ההזרקה, זריקות להיות קשה כי המחט מתקשה פירסינג העובר. כמות המים הנכונה היא הנקודה שבה לעוברים יש מניסקוס של מים סביבם, אך הכיסוי אינו צף על גבי המים וגורם לעוברים לדחוף מתחת לכיסוי. זה קריטי כדי לפקח על כמות המים סביב העוברים במהלך זריקות. מוסיפים מים לפי הצורך כדי לשמור על העוברים לחים.</li>
	<li>מוסיפים מים בזהירות על ידי הרטבת מברשת עם מים והעברת המים לקצה האחורי של נייר המסנן. הוספת מים בצורה זו מאפשרת להוסיף מים בצורה איטית ומבוקרת, כך שרק מספיק מתווסף כדי לשמור על העוברים לחים. יותר מדי מים יכולים לגרום לעוברים לצוף מחוץ ליישור, מה שמקשה על הזרקת העוברים.</li>
	<li>תערובת הזרקת עומס גב לתוך מחט microinjection. הוסף כ 0.5 כדי 1 μL של תערובת הזרקה לתוך המחט באמצעות מילוי מחט borosilicate מצויר ביד, טיפים צינור טעינת ג'ל ניתן להשתמש גם. תערובת ההזרקה מורכבת RNA מדריך אחד או יותר (80 ng / μL כל אחד) שנועד למקד לוקוס ספציפי מעורבב עם חלבון Cas9 רקומביננטי מסחרי (300 ng / μL).</li>
	<li>החל מלחץ ההזרקה ב 30 psi, לחץ על ההדק ההזרקה כדי לגרש אוויר מקצה המחט. זה יאלץ את תערובת ההזרקה לקצה המחט ומאפשר לתערובת ההזרקה לזרום. בשלב זה, לאט להגדיל את הלחץ להחזיק / קבוע עד חומר ההזרקה מתחיל לזרום, ולאחר מכן לסגת להחזיק / לחץ קבוע, כך שהוא ממש מתחת לנקודת תערובת ההזרקה זורם מן המחט. ההגדרה מגודרת צריך לספק רק מספיק חומר הזרקה, כך כמות קטנה של חומר ניתן לראות להיכנס העובר. הערה: הזרקת עוברים זבוב חול תחת שמן halocarbon דומה לפרוטוקולים אחרים המשמשים Drosophila ו יתושים נבדק בתחילה, אולם אחוז ההישרדות עבור זריקות אלה היה נמוך מאוד. ההישרדות שופרה על ידי מעבר לזריקות על נייר סינון לח כמתואר לעיל.</li>
	<li>הכנס את המחט לצד העובר. השתמש בכיסוי מאחורי העובר כמו backstop אשר יסייע המחט לנקב את העובר. לספק כמות קטנה של תערובת הזרקה לתוך העובר לפני בעדינות להסיר את המחט.</li>
	<li>מיד לאחר הסרת המחט, לחץ על המזרק כדי להסיר כל חומר ממולא לאחור מקצה המחט. זה יעזור למנוע את המחט סתימת.</li>
	<li>המשך לעובר הבא. בין כל זריקה, ודא כי נייר המסנן לח והמחט אינה סתומה.</li>
	<li>לאחר שכל העוברים הוזרקו, לספור את מספר העוברים מוזרקים כדי לשמור על ספירת ריצה.</li>
	<li>הסר את הכיסוי על-ידי הוספת מים לנייר הסינון כך שהכיסוי יצוף. בשלב זה, השתמש בבדיקה (מקל אפליקטור עץ עם סיכת חרק מודבק לקצה) כדי להחזיק את נייר המסנן במקום בעוד אצבע משמשת כדי למשוך את הכיסוי מן העוברים מוזרקים.</li>
	<li>מחק מים עודפים מנייר הסינון לאחר הסרת העטיפה.</li>
</ol>4. גידול לאחר הזרקה (G0) (איור 4)
<ol><li>מעבירים את נייר המסנן עם העוברים על גבי מספר שכבות של נייר סינון לח הממוקם בצלחת פטרי כדי לשמור על לחות. שמור את העוברים כאן בזמן הדרוש כדי להזריק עוברים אחרים. עוברים יכולים להיות מוחזקים לכל היותר 3 שעות כאלה. לאחר ההזרקה הם יהפכו לאט חום.</li>
	<li>לאחר כל העוברים הוזרקו, להעביר אותם באופן ידני על סירי גבס בגודל קטן לח בעבר. אין לשים יותר מדי עוברים בכל סיר ולשמור על מרחק ביניהם, כדי למנוע זיהום פטרייתי אפשרי בין אנשים. מכסים את הסירים במסך ומאחסנים אותם כפי שנעשה בדרך כלל עבור ביצי מושבת זבוב חול, המתוחזקות באינקובטורים ב 70% לחות ו 26 °C (60 °F), במהלך כל הפיתוח שלהם.</li>
	<li>ביום הראשון שלאחר ההזרקה, הסר את כל העוברים הפגומים והמתים עם מברשת צבע. הוסף 100 μL של 0.5% חומצה propionic, טיפה אחר טיפה, על סירי טיח המכילים את העוברים מוזרקים להגביל זיהום פטרייתי. שחרור ציטופלסמה מעוברים שנפגעו במהלך תהליך ההזרקה הוא חיובי במיוחד לצמיחה פטרייתית.</li>
	<li>בדוק את סירי הגבס כל יום ולהסיר את כל העוברים רעים או מתים. אם פטרייה קיימת, להסיר את כל העוברים הנגועים ולהוסיף כמה טיפות של 0.5% חומצה propionic.</li>
	<li>הזחלים בוקעים בין היום ה-8 ל-12 לאחר ההזרקה. פעמיים ביום, להעביר את הזחלים החדשים הגיח על סירי גבס חדשים, בקבוצות של 5-10 מקסימום. מוסיפים כמות קטנה של מזון ולבדוק את האוכל 2-3 פעמים בשבוע.<ol>
<li>בזהירות לפקח על כמות המזון הזחל, כמו יותר מדי מגדיל מאוד את הסיכון לזיהום פטרייתי. זחלי זבוב חול לשרוד טוב יותר בקבוצות עם זאת הם יכולים להיות קניבליים אם אין מספיק מזון.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כאשר הזחלים גורים, להפריד אותם על ידי מין כדי לשמור על הנקבות כמו בתולות. אם יש הרבה ניצולים, להשליך את הזכרים ולשמור רק את הנקבות. הערה: זכרים ונקבות כאחד יכולים לשאת ולהעביר מוטציות. עם זאת, כמו נקבות צריך להישמר בתולות לפני שהם להיות חצה, קל יותר להשתמש רק G0 מוזרק נקבות, כדי למנוע צורך להפריד wt חרקים על ידי מין. זכרי G0 יכולים להישמר כגיבוי אם מספר הניצולים הבוגרים נמוך ובמקרה זה יוזדווגו עם נקבות בתולות ממוינות.</li>
</ol>5. בחירה והקרנה של אללים מוטנטים (איור 5)
<ol><li>המוני לחצות את נקבות G0 עם זכרים wt בכלוב. דם להאכיל אותם לגמרי, כפי שנעשה לתחזוקת מושבה נורמלית.</li>
	<li>יום אחד לאחר האכלת הדם, להעביר כל נקבת G0 עם 2-3 זכרים wt לתוך צינורות גבס בודדים באמצעות שאיפה בפה. להאכיל את הזבובים עם סוכר על כדור כותנה קטן השתנה כל יום ולהשתמש במזרק מים כדי להבטיח את לחות הטיח מתאים הטלת ביצה.</li>
	<li>לאחר נקבות G0 הטילו ביצים (המקביל G1), לאסוף את גופם בודדים, מבואר צינורות Eppendorf עבור genotyping מאוחר יותר. לשמור על העוברים כפי שנעשה בדרך כלל עבור מושבות wt.</li>
	<li>לחלץ את ה-DNA מן הנקבות G0 בשיטת הבחירה.</li>
	<li>לסנן את ה-DNA לנוכחות של מוטציות, למשל על ידי עיצוב PCR assay באמצעות פריימרים המקיפים את האזור של חתכים CRISPR צפוי.</li>
	<li>שמור רק את עוברי G1 שהונחו על ידי נקבות G0 מראה ראיות לשינוי. כאשר עוברים אלה G1 לפתח גלמים, להפריד אותם על ידי מין ולשמור רק את הנקבות. לחצות את נקבות G1 מאותה נקבת G0 לזכרים wt, להאכיל אותם בדם, ואז להעביר בקבוצות קטנות של 2-3 נקבות ו 4-5 זכרים לתוך מיכלים בגודל קטן. הערה: כל האנשים G1 יש סיכוי לשאת מוטציה ייחודית, אז אם מספר האנשים ששרדו הוא לא גבוה מדי אז עדיף לחצות G1 נקבות בנפרד עם זכרים wt. המקרה של מספר נקבות הנושאות מוטציה שונה נוכח בצינור זהה הוא נדיר אבל יכול להתרחש. אם מקרה כזה נצפה לאחר genotyping, נקבות צאצאי G2 אז צריך להיות מזדווג בנפרד עם זכרים wt. ערכת הזדווגות זו מונעת את האפשרות של מוטציות מרובות בצאצאים.</li>
	<li>לאחר הטלת ביצים, לאסוף את הגופות הנשיות G1 ולסנן אותם מוטציות. שמור רק את הצינורות שבהם לפחות נקבה אחת הראתה ראיות למוטציה.</li>
	<li>במשך דורות מאוחרים יותר לעשות זוג אחד בצלבים. לאחר הטלת ביצים, הורים מסך לנוכחות של מוטציה. חזרו על הפעולה בכל דור עד ששני ההורים יהיו הומוזיגיים לאותה מוטציה. ברגע שזוהו, הם יהיו המייסדים של מלאי מוטנטים הומוזיגי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lawyer, P., Killick-Kendrick, M., Rowland, T., Rowton, E., Volf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laboratory+colonization+and+mass+rearing+of+phlebotomine+sand+flies+(Diptera,+Psychodidae).">Laboratory colonization and mass rearing of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae).</a> Parasite. 24, 42 (2017).</li><li>Pelletier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+recognition+of+Leishmania+major+poly-beta-galactosyl+epitopes+by+galectin-9:+possible+implication+of+galectin-9+in+interaction+between+L.+major+and+host+cells.">Specific recognition of Leishmania major poly-beta-galactosyl epitopes by galectin-9: possible implication of galectin-9 in interaction between L. major and host cells.</a> Journal Biological Chemistry. 278 (25), 22223-22230 (2003).</li><li>Kamhawi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+insect+galectins+in+parasite+survival.">A role for insect galectins in parasite survival.</a> Cell. 119 (3), 329-341 (2004).</li><li>Louradour, I., Ghosh, K., Inbar, E., Sacks, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+Mutagenesis+in+Phlebotomus+papatasi:+the+Immune+Deficiency+Pathway+Impacts+Vector+Competence+for+Leishmania+major.">CRISPR/Cas9 Mutagenesis in Phlebotomus papatasi: the Immune Deficiency Pathway Impacts Vector Competence for Leishmania major.</a> MBio. 10 (4), (2019).</li><li>Xi, Z., Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Aedes+aegypti+toll+pathway+controls+dengue+virus+infection.">The Aedes aegypti toll pathway controls dengue virus infection.</a> PLoS Pathogens. 4 (7), 1000098 (2008).</li><li>Ramirez, J. L., Dimopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Toll+immune+signaling+pathway+control+conserved+anti-dengue+defenses+across+diverse+Ae.+aegypti+strains+and+against+multiple+dengue+virus+serotypes.">The Toll immune signaling pathway control conserved anti-dengue defenses across diverse Ae. aegypti strains and against multiple dengue virus serotypes.</a> Development and Comparative Immunology. 34 (6), 625-629 (2010).</li><li>Ramirez, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+tripartite+interactions+between+the+Aedes+aegypti+midgut+microbiota,+innate+immune+system+and+dengue+virus+influences+vector+competence.">Reciprocal tripartite interactions between the Aedes aegypti midgut microbiota, innate immune system and dengue virus influences vector competence.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 6 (3), 1561 (2012).</li><li>Hu, C., Aksoy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+responses+regulate+trypanosome+parasite+infection+of+the+tsetse+fly+Glossina+morsitans+morsitans.">Innate immune responses regulate trypanosome parasite infection of the tsetse fly Glossina morsitans morsitans.</a> Molecular Microbiology. 60 (5), 1194-1204 (2006).</li><li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anopheles+gambiae+PGRPLC-mediated+defense+against+bacteria+modulates+infections+with+malaria+parasites.">Anopheles gambiae PGRPLC-mediated defense against bacteria modulates infections with malaria parasites.</a> PLoS Pathogens. 5 (8), 1000542 (2009).</li><li>Meister, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+signaling+pathways+regulating+bacterial+and+malaria+parasite+infection+of+the+mosquito+Anopheles+gambiae.">Immune signaling pathways regulating bacterial and malaria parasite infection of the mosquito Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 102 (32), 11420-11425 (2005).</li><li>Telleria, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caspar-like+gene+depletion+reduces+Leishmania+infection+in+sand+fly+host+Lutzomyia+longipalpis.">Caspar-like gene depletion reduces Leishmania infection in sand fly host Lutzomyia longipalpis.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (16), 12985-12993 (2012).</li><li>Sant'Anna, M. R., Alexander, B., Bates, P. A., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+phlebotomine+sand+flies:+Xanthine+dehydrogenase+knock+down+by+dsRNA+microinjections.">Gene silencing in phlebotomine sand flies: Xanthine dehydrogenase knock down by dsRNA microinjections.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 38 (6), 652-660 (2008).</li><li>Sant'anna, M. R., Diaz-Albiter, H., Mubaraki, M., Dillon, R. J., Bates, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+trypsin+expression+in+Lutzomyia+longipalpis+using+RNAi+enhances+the+survival+of+Leishmania.">Inhibition of trypsin expression in Lutzomyia longipalpis using RNAi enhances the survival of Leishmania.</a> Parasites and Vectors. 2 (1), 62 (2009).</li><li>Diaz-Albiter, H., Mitford, R., Genta, F. A., Sant'Anna, M. R., Dillon, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+scavenging+by+catalase+is+important+for+female+Lutzomyia+longipalpis+fecundity+and+mortality.">Reactive oxygen species scavenging by catalase is important for female Lutzomyia longipalpis fecundity and mortality.</a> PLoS One. 6 (3), 17486 (2011).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Pawelczak, K. S., Gavande, N. S., VanderVere-Carozza, P. S., Turchi, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulating+DNA+Repair+Pathways+to+Improve+Precision+Genome+Engineering.">Modulating DNA Repair Pathways to Improve Precision Genome Engineering.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 389-396 (2018).</li><li>Martin-Martin, I., Aryan, A., Meneses, C., Adelman, Z. N., Calvo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sand+fly+embryo+microinjection+for+gene+editing+by+CRISPR/Cas9.">Optimization of sand fly embryo microinjection for gene editing by CRISPR/Cas9.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 12 (9), 0006769 (2018).</li><li>Meuti, M., Harrell, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+and+Injecting+Embryos+of+Culex+Mosquitoes+to+Generate+Null+Mutations+Using+CRISPR/Cas9.">Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations Using CRISPR/Cas9.</a> JoVE. (163), e61651 (2020).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+into+arthropod+ovaries+for+heritable+germline+gene+editing.">Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing.</a> Nature Communications. 9 (1), 3008 (2018).</li><li>Chaverra-Rodriguez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germline+mutagenesis+of+Nasonia+vitripennis+through+ovarian+delivery+of+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein.">Germline mutagenesis of Nasonia vitripennis through ovarian delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein.</a> Insect Molecular Biology. , (2020).</li><li>Heu, C. C., McCullough, F. M., Luan, J., Rasgon, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas9-Based+Genome+Editing+in+the+Silverleaf+Whitefly+(Bemisia+tabaci).">CRISPR-Cas9-Based Genome Editing in the Silverleaf Whitefly (Bemisia tabaci).</a> CRISPR Journal. 3 (2), 89-96 (2020).</li><li>Macias, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-Mediated+Gene-Editing+in+the+Malaria+Mosquito+Anopheles+stephensi+by+ReMOT+Control.">Cas9-Mediated Gene-Editing in the Malaria Mosquito Anopheles stephensi by ReMOT Control.</a> Genes, Genomes and Genetics (Bethesda). 10 (4), 1353-1360 (2020).</li></ol>

אנו מציגים כאן שיטת מיקרו-אינג'ינג עובר שפותחה לאחרונה עבור mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR / Cas9 בפליבוטומוס פאפטאסי חול זבובים. מיקרו-לינקציה של עוברים לשינוי גנטי של חרקים פותחה בדרוסופילה באמצע שנות ה-80 של21 וכיום נעשה בה שימוש שגרתי במגוון רחב של חרקים. שיטות אחרות להעברת ?...

מחלות המועברות על ידי וקטור מהוות איום מרכזי על בריאות הציבור באבולוציה מתמדת. מאות מינים וקטוריים הפרוסים על פני משפחות פילוגניות שונות מאוד (למשל, יתושים, קרציות, פרעושים) אחראים להעברת מספר עצום של פתוגנים מיקרוביאליים, וכתוצאה מכך יותר מ -700,000 מקרי מוות של בני אדם בשנה, על פי ארגון הבריאות העולמי. בין חרקים וקטוריים, זבובי חול פלבוטומין (דיפטרה, פסיכודידיה) מהווים קבוצה עצומה, עם 80 מינים וקטורים מוכחים המציגים תכונות פנוטיפיות מובהקות ויבולות וקטוריות שנמצאו באזורים גיאוגרפיים שונים. הם וקטורים עבור טפילי פרוטוזואן של הסוג לישמניה, גורם סביב 1.3 מיליון מקרים חדשים של לישמניאסים בין 20,000 ל 30,000 מקרי מוות בשנה. התוצאות הקליניות של לישמניאס מגוונות, עם תסמינים הנעים בין נגעים עוריים המגבילים את עצמם ועד להפצה הקרביים שהיא קטלנית בהיעדר טיפול.
זבובי חול הם חרקים יבשתיים לחלוטין. מחזור החיים שלהם, ארוך יחסית לדיפטרה אחרת, נמשך עד שלושה חודשים, בהתאם לפרמטרים שונים כגון טמפרטורה, לחות ותזונה. הוא מורכב משלב עוברי אחד (6 עד 11 ימים), ארבעה שלבי זחל (הנמשכת בסך הכל 23 עד 25 ימים) ושלב פופי אחד (9 עד 10 ימים) ואחריו מטמורפוזה ולאחר מכן בגרות. זבובי חול דורשים סביבה לחה וחמה לגידול. זכרים ונקבות כאחד ניזונים מסוכרים, המתקבלים בטבע מצוף פרחים. רק נקבות הן מאכילות דם, שכן הן דורשות חלבונים המתקבלים מארוחת הדם לייצור ביצים1.
מוקד מחקר חשוב הוא לזהות את אופי האינטראקציות הווקטוריות/טפיליות המובילות להתפתחות זיהומים הניתנים להעברה. כמו חרקים וקטוריים אחרים, פרמטרים מהותיים לזבובי חול הוכחו כמשפיעים על יכולתם הווקטורית, המוגדרת כיכולתם לשאת ולהעביר פתוגנים למארחיהם. לדוגמה, הביטוי של גלקטינים על ידי חול פפטאסי Phlebotomus לטוס תאים midgut, מתנהג כמו קולטנים זיהוי רכיבים משטח טפיל, יכול להשפיע ישירות על היכולת הווקטורית שלהם עבור Leishmania גדול2,3. מסלול התגובה החיסונית חרקים, מחסור במערכת החיסון (IMD), הוא גם חיוני עבור Phlebotomus papatasi חול זבוב וקטור יכולת עבור לישמניה גדול4. תפקיד קריטי עבור מסלולי תגובה חיסונית חרקים וקטוריים בשליטה על העברתם של פתוגנים זיהומיות דווח באופן דומה יתושים Aedes aegypti 5,6,7, ב tsetse לטוס Glossina morsitans8, וב Anopheles gambiae יתושים 9,10.
מחקרים על זבוב חול / אינטראקציותלישמניה הוגבלו על ידי היעדר שיטות לשינוי ביטוי גנים המותאמות לשימוש בחרקים אלה. רק הסרת רגולציה של גנים על ידי RNA מפריע קטן (siRNA)בוצעה 11,12,13,14 עד לאחרונה. הטכניקה, המוגבלת על ידי התמותה הקשורה למיקרו-אינג'ים של נקבות בוגרות, מובילה רק לאובדן חלקי של תפקוד, שלא ניתן להעביר מדור לדור.
טכנולוגיית CRISPR/Cas9 חוללה מהפכה במחקר הגנומי הפונקציונלי באורגניזמים שאינם מדגמים כגון זבובי חול. שונה ממערכת החיסון האדפטיבית בפרוקריוטים להגנה מפני בקטריופאג'ים15,16, מערכת CRISPR Cas9 הותאמה במהירות ככלי לעריכת גנום לאורגניזמים אוקריוטיים מעולים, כולל חרקים. העיקרון של עריכת גנום ממוקד CRISPR/Cas9 מבוסס על המשלימות של RNA מדריך יחיד (sgRNA) לוקוס גנומי ספציפי. גרעין Cas9 נקשר לסגנ"א ויוצר שבירת דנ"א דו-גדילי (dsDNA) בדנ"א הגנומי שבו הסג'רנה מתחבר לרצף המשלים שלו. קומפלקס Cas9-sgRNA מונחה לרצף היעד על ידי 17 עד 20 בסיסים משלימים בסגנ"א למוקד הנבחר, ניתן לתקן את הפסקת dsDNA על ידי שני מסלולים עצמאיים: הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) או תיקון מונחה הומולוגיה (HDR)17. תיקון NHEJ כרוך בסגירה פשוטה של ההפסקה אך לעתים קרובות מוביל לאירועי הוספה/מחיקה קטנים. תיקון דנ"א באמצעות HDR משתמש במולקולת דנ"א תורמת החולקת הומולוגיה עם הדנ"א של המטרה כתבנית לתיקון. חרקים מחזיקים בשתי המכונות.
טכנולוגיית CRISPR/Cas9 יכולה ליצור מוטציות בלוקוס שנבחר, דרך מסלול התיקון של NHEJ; או לאסטרטגיות מורכבות יותר לעריכת גנום, כגון דפיקות או כתבי ביטוי, דרך מסלול HDR עם תבנית תורמת מתאימה. בזבובי חול, אללים מוטנטים ריקים של גורם התגובה החיסונית Relish נוצרו באמצעות CRISPR בתיווך NHEJ בפלבוטומוס פאפטאסי4. עוברי זבוב חול הוזרקו גם במחקר אחר עם תערובת CRISPR/Cas9 המכוונת לגן המקודד צהוב. ובכל זאת, לא היו מבוגרים הנושאים את המוטציה18. אנו מתארים כאן שיטה מפורטת של זבוב חול mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR /Cas9 בתיווך NHEJ, עם דגש מסוים על microinjection העובר, צעד קריטי של הפרוטוקול.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Black Filter Paper 4.25CM PK100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28342-012</td>
			<td>Cut into rectangles that are approximately 46 X 22mm. These are placed between the slide and the coverslip and act as a moist base layer for the embryos during injection.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-543A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Any brand</td>
			<td></td>
			<td>For aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-A3</td>
			<td>Base layer of the microinjection set up Figure 2A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect cage</td>
			<td>custom made or several commercial options</td>
			<td></td>
			<td>polycarbonate cage for adults holding and mating Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval food</td>
			<td>custom made</td>
			<td></td>
			<td>a mix of rabbit chow and rabbit feces Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcaps 100 ml</td>
			<td>Drummond</td>
			<td>1-000-1000</td>
			<td>Used to back fill microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth aspirator</td>
			<td>John W. Hock Company</td>
			<td>Model 612</td>
			<td>mouth aspirator with HEPA filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus SZX12</td>
			<td>Olympus Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovipots</td>
			<td>Nalge company</td>
			<td></td>
			<td>ovipots are made from 125-ml or 500-ml straigh-sided plolypropylene jars modified by drilling 2.5cm holes in the bottom and filled with 1cm of plaster of Paris. Lawyer, Phillip, Mireille Killick-Kendrick, Tobin Rowland, Edgar Rowton, and Petr Volf. &#8220;Laboratory Colonization and Mass Rearing of Phlebotomine Sand Flies (Diptera, Psychodidae).&#8221; Parasite 24. Accessed August 6, 2020. https://doi.org/10.1051/parasite/2017041.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint Brush 6-0</td>
			<td>Any Art Supply Company</td>
			<td>n/a</td>
			<td>Used for aligning embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propionic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>402907</td>
			<td>antifungal agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100-3</td>
			<td>Used for making microinjection needles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trio-MPC100 Controller and MP845 Manipulator</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td></td>
			<td>Microinjection Controller and Micromanipulator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sand fly (phlebotomus papatasi) embryo microinjection for crispr/cas9 mutagenesis

זבובי חול הם הווקטורים הטבעיים של מיני לישמניה, טפילי פרוטוזואן המייצרים קשת רחבה של תסמינים החל בנגעים עוריים ועד פתולוגיה קרבית. פענוח אופי האינטראקציות הווקטוריות/טפיליות הוא בעל חשיבות עליונה להבנה טובה יותר של שידור לישמניה למארחיהם. בין הפרמטרים השולטים ביכולת וקטור זבוב החול (כלומר היכולת שלהם לשאת ולהעביר פתוגנים), פרמטרים מהותיים לחרקים אלה הוצגו לשחק תפקיד מפתח. תגובת חיסון חרקים, למשל, משפיעה על יכולת וקטור זבוב חול לישמניה. המחקר של פרמטרים כאלה הוגבל על ידי היעדר שיטות של שינוי ביטוי גנים מותאם לשימוש באורגניזמים אלה שאינם מודל. הסרת רגולציה של גנים על ידי RNA מפריע קטן (siRNA) אפשרית, אך בנוסף להיותה מאתגרת מבחינה טכנית, ההשתקה מובילה לאובדן חלקי בלבד של תפקוד, שלא ניתן להעביר מדור לדור. mutagenesis ממוקד על ידי טכנולוגיית CRISPR / Cas9 הותאם לאחרונה זבוב חול פפטאסי Phlebotomus. טכניקה זו מובילה ליצירת מוטציות הניתנות להעברה במקום שנבחר במיוחד, ומאפשרת לחקור את הגנים המעניינים. מערכת CRISPR/Cas9 מסתמכת על אינדוקציה של הפסקות דנ"א דו-גדילי ממוקדות, שתוקנה מאוחר יותר על ידי הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ) או על ידי תיקון מונחה הומולוגיה (HDR). NHEJ מורכב מסגירה פשוטה של ההפסקה ולעתים קרובות מוביל לאירועי הוספה/מחיקה קטנים. לעומת זאת, HDR משתמש בנוכחות של מולקולת DNA תורמת שיתוף הומולוגיה עם ה-DNA היעד כתבנית לתיקון. כאן, אנו מציגים שיטת microinjection עובר זבוב חול עבור mutagenesis ממוקד על ידי CRISPR / Cas9 באמצעות NHEJ, שהיא טכניקת שינוי הגנום היחידה המותאמת וקטורים זבוב חול עד כה.

פרוטוקול המיקרו-injection CRISPR/Cas9 המתואר כאן ליצירת מוטנטים של זבוב חול הוקם בפרסום הקודם4. גישה זו יצרה mutagenesis יעיל מאוד, כמו 11 מתוך 540 אנשים שרדו את ההליך, מתוכם 9 היו מוטנטים. בעת תכנון מדריכים למוטציה CRISPR/Cas9, צעד ראשון קריטי הוא לרצף את האזור סביב האזור שיש לפלח. התבנית לריצוף צריכה ...

Watch this Scientific Journal Video about Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis at JoVE.com

Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

פרוטוקול זה מפרט את השלבים של CRISPR / Cas9 mutagenesis ממוקד זבובי חול: אוסף עוברים, הזרקה, גידול חרקים, זיהוי, כמו גם מבחר של מוטציות של עניין.

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

Sand flies are the natural vectors for Leishmania species, protozoan parasites producing a broad spectrum of symptoms ranging from cutaneous lesions to ...

sand-fly-phlebotomus-papatasi-embryo-microinjection-for-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Genetics

Sand Fly (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

7.0K Views.  National Institutes of Health. פרוטוקול זה מפרט את השלבים של CRISPR / Cas9 mutagenesis ממוקד זבובי חול: אוסף עוברים, הזרקה, גידול חרקים, זיהוי, כמו גם מבחר של מוטציות של עניין.

Video: Sand Fly Phlebotomus papatasi Embryo Microinjection for CRISPR/Cas9 Mutagenesis

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. This is due to its reproductive behavior: females damage the external surface of fruits and vegetables when they lay eggs and the hatched larvae feed on their pulp. Wild C. capitata populations are traditionally controlled through insecticide spraying and/or eco-friendly approaches, the most successful being the Sterile Insect Technique (SIT). The SIT relies on mass-rearing, radiation-based sterilization and field release of males that retain their capacity to mate but are not able to generate fertile progeny. The advent and the subsequent rapid development of biotechnological tools, together with the availability of the medfly genome sequence, has greatly boosted our understanding of the biology of this species. This favored the proliferation of new strategies for genome manipulation, which can be applied to population control.
In this context, embryo microinjection plays a dual role in expanding the toolbox for medfly control. The ability to interfere with the function of genes that regulate key biological processes, indeed, expands our understanding of the molecular machinery underlying medfly invasiveness. Furthermore, the ability to achieve germ-line transformation facilitates the production of multiple transgenic strains that can be tested for future field applications in novel SIT settings. Indeed, genetic manipulation can be used to confer desirable traits that can, for example, be used to monitor sterile male performance in the field, or that can result in early life-stage lethality. Here we describe a method to microinject nucleic acids into medfly embryos to achieve these two main goals.

Delivery of Nucleic Acids through Embryo Microinjection in the Worldwide Agricultural Pest Insect, Ceratitis capitata

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) is a worldwide pest of agriculture. A deeper understanding of its biology is key to control medfly populations and thus reduce economic impact. Embryo microinjection is a fundamental tool allowing both germ-line transformation and reverse genetics studies in this species.

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,<em&gt; זבוב הפירות הים תיכוני</em

The Mediterranean fruit fly (medfly) Ceratitis capitata (Wiedemann) (Diptera: Tephritidae) is a pest species with extremely high agricultural relevance. ...

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex determination, venom synthesis, and host-symbiont interactions, among others. A major limitation of working with this organism is the lack of effective protocols to perform directed genome modifications. An important part of genome modification is delivery of editing reagents, including CRISPR/Cas9 molecules, into embryos through microinjection. While microinjection is well established in many model organisms, this technique is particularly challenging to perform in N. vitripennis primarily due to its small embryo size, and the fact that embryonic development occurs entirely within a parasitized blowfly pupa. The following procedure overcomes these significant challenges while demonstrating a streamlined, visual procedure for effectively removing wasp embryos from parasitized host pupae, microinjecting them, and carefully transplanting them back into the host for continuation and completion of development. This protocol will strongly enhance the capability of research groups to perform advanced genome modifications in this organism.

Embryo Microinjection and Transplantation Technique for Nasonia vitripennis Genome Manipulation

Microinjection of Nasonia vitripennis embryos is an essential method for generating heritable genome modifications. Described here is a detailed procedure for microinjection and transplantation of Nasonia vitripennis embryos, which will greatly facilitate future genome manipulation in this organism.

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

The jewel wasp Nasonia vitripennis has emerged as an effective model system for the study of processes including sex determination, haplo-diploid sex ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how genes regulate social traits, we have developed mutant ants via delivery of CRISPR complex into young embryos during their syncytial stage. Here, we provide a protocol of CRISPR-mediated mutagenesis in Harpegnathos saltator, a ponerine ant species that displays striking phenotypic plasticity. H. saltator ants are readily reared in a laboratory setting. Embryos are collected for microinjection with Cas9 proteins and in vitro synthesized small guide RNAs (sgRNAs) using home-made quartz needles. Post-injection embryos are reared outside the colony. Following emergence of the first larva, all embryos and larvae are transported to a nest box with a few nursing workers for further development. This protocol is suitable for inducing mutagenesis for analysis of caste-specific physiology and social behavior in ants, but may also be applied to a broader spectrum of hymenopterans and other insects.

Embryo Injections for CRISPR-Mediated Mutagenesis in the Ant Harpegnathos saltator

Many characteristics of insect eusociality rely on within-colony communication and division of labor. Genetic manipulation of key regulatory genes in ant embryos via microinjection and CRISPR-mediated mutagenesis provides insights into the nature of altruistic behavior in eusocial insects.

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

The unique traits of eusocial insects, such as social behavior and reproductive division of labor, are controlled by their genetic system. To address how ...

phiC31 טרנסגנזה של עובר בתיווך אינטגראז בדרוזופילה

Embryo Microinjection for Transgenesis in Drosophila

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the construction of transgenic flies. Microinjection requires some types of equipment, including a microinjector, a micromanipulator, an inverted microscope, and a stereo microscope.&#160;Plasmids isolated with a plasmid miniprep kit are qualified for microinjection. Embryos at the pre-blastoderm or syncytial blastoderm stage, where nuclei share a common cytoplasm, are subjected to microinjection. A cell strainer eases the process of dechorionating embryos. The optimal time for dechorionation and desiccation of embryos needs to be determined experimentally. To increase the efficiency of embryo microinjection, needles prepared by a puller need to be beveled by a needle grinder. In the process of grinding needles, we utilize a foot air pump with a pressure gauge to avoid the capillary effect of the needle tip. We routinely inject 120-140 embryos for each plasmid and obtain at least one transgenic line for around 85% of plasmids. This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and&#160;presents a detailed protocol for embryo microinjection for transgenesis in Drosophila.

מחבר זרקור: אופטימיזציה של מיקרו-הזרקה לעובר עבור טרנסגנזה בדרוזופילה

This article takes the phiC31 integrase-mediated transgenesis in Drosophila as an example and presents an optimized protocol for embryo microinjection,&#160;a crucial step for creating transgenic flies.

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

Transgenesis in Drosophila is an essential approach to studying gene function at the organism level. Embryo microinjection is a crucial step for the ...

Genome Editing in the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti using CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering field and opened the doors for precise genome editing in multiple species, including non-model organisms. In the mosquito Aedes aegypti, loss-of-function mutations and DNA insertions have been accomplished with this technology. Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology, focusing on both the generation of gene knockout and knockin lines. In this protocol, quartz needles are filled with a mixture of guide RNA, recombinant Cas9, and a plasmid containing a DNA cassette encoding a gene for a fluorescent marker, if gene knockin is desired. Embryos at the preblastoderm stage are lined up onto a strip of double-sided sticky tape placed onto a coverslip, which is subsequently mounted onto a glass slide. With the help of a microinjector, the needles are inserted gently into the posterior end of the embryos and a small volume of the CRISPR mixture is dispensed. When the embryos are hatched, the larvae are checked under the fluorescent scope, and the pupae are sex-sorted and separated in different cages. Once the adults emerge, these are reciprocally crossed with wild-type individuals, blood-fed, and placed for egg laying. Once these eggs are hatched, the fluorescent larvae collected represent individuals with stable insertion of the DNA cassette into their genome. These larvae are then grown to the adult stage, outcrossed to wild-type individuals, and then further assessed through molecular techniques to confirm that the exact sequence of the DNA cassette is present at the desired site of the mosquito genome. Homozygous lines can also be obtained by following the provided pipeline of crossing schema and molecular screening of the mutations.

Here, we describe a detailed protocol for genome editing through embryonic microinjection in the mosquito A. aegypti using the CRISPR-Cas9 technology.

עריכת גנום ביתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti באמצעות CRISPR-Cas9

The emergence of the clustered, regularly interspersed, short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 technology has revolutionized the genetic engineering ...

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (H&#252;bner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional genomics, and behavioral studies has made H. armigera a model species in Lepidoptera Noctuidae. To study the in vivo functions of and interactions between different genes, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ associated protein 9 (Cas9) genome editing technology is a convenient and effective method used for performing functional genomic studies. In this study, we provide a step-by-step systematic method to complete gene knockout in H. armigera using the CRISPR/Cas9 system. The design and synthesis of guide RNA (gRNA) are described in detail. Then, the subsequent steps consisting of gene-specific primer design for guide RNA (gRNA) creation, embryo collection, microinjection, insect rearing, and mutant detection are summarized. Finally, troubleshooting advice and notes are provided to improve the efficiency of gene editing. Our method will serve as a reference for the application of CRISPR/Cas9 genome editing in H. armigera as well as other Lepidopteran moths.

Embryo Microinjection and Knockout Mutant Identification of CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera H&#252;bner

Presented here is a protocol of Helicoverpa armigera (H&#252;bner) embryo microinjection and knockout mutant identification created by CRISPR/Cas9 genome editing. Mutant insects enable further research of gene function and interaction among different genes in vivo.

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

The cotton bollworm, Helicoverpa armigera, is one of the most destructive pests in the world. A combination of molecular genetics, physiology, functional ...

Behavior

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

The corn planthopper, Peregrinus maidis, is&#160;a pest of maize and a vector of several maize viruses. Previously published methods describe the triggering of RNA interference (RNAi) in P. maidis through microinjection of double-stranded RNAs (dsRNAs) into nymphs and adults. Despite the power of RNAi, phenotypes generated via this technique are transient and lack long-term Mendelian inheritance. Therefore, the P. maidis toolbox needs to be expanded to include functional genomic tools that would enable the production of stable mutant strains, opening the door for researchers to bring new control methods to bear on this economically important pest. However, unlike the dsRNAs used for RNAi, the components used in CRISPR/Cas9-based genome editing and germline transformation do not easily cross cell membranes. As a result, plasmid DNAs, RNAs, and/or proteins must be microinjected into embryos before the embryo cellularizes, making the timing of injection a critical factor for success. To that end, an agarose-based egg-lay method was developed to allow embryos to be harvested from P. maidis females at relatively short intervals. Herein are provided detailed protocols for collecting and microinjecting precellular P. maidis embryos with CRISPR components (Cas9 nuclease that has been complexed with guide RNAs), and results of Cas9-based gene knockout of a P. maidis eye-color gene, white, are presented. Although these protocols describe CRISPR/Cas9-genome editing in P. maidis, they can also be used for producing transgenic P. maidis via germline transformation by simply changing the composition of the injection solution.

Microinjection of Corn Planthopper, Peregrinus maidis, Embryos for CRISPR/Cas9 Genome Editing

Herein are protocols for collecting and microinjecting precellular corn planthopper embryos for the purpose of modifying their genome via CRISPR/Cas9-based genome editing or for the addition of marked transposable elements through germline transformation.

זבוב חול (פלבוטומוס פפטאסי) עובר מיקרו-אינג'קציה עבור CRISPR/Cas9 מוטגנזה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

משלוח חומצות גרעין דרך Microinjection העובר חרקי ההדברה החקלאיים ברחבי העולם,

העובר Microinjection, טכניקת ההשתלה מניפולציה הגנום Nasonia vitripennis

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

זריקות עובר למוטגנזה בתיווך קריספר במלח הנמלה הרפגנתוס

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

מיקרו-הזרקה של עובר לטרנסגנזה בדרוזופילה

עריכת גנום ביתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti באמצעות CRISPR-Cas9

זיהוי מוטציות מיקרו-חדיר ונוקאאוט של CRISPR/Cas9 גנום ערוך Helicoverpa Armigera (Hübner)

מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9