이것은 효모 MoClo 키트를 사용하여 다중 유전자 플라스미드를 조립하기위한 상세한 프로토콜입니다. 이 방법은 다양한 다중 유전자 급우의 편리한 복제를 가능하게합니다. 그것은 관련 부품의 큰 라이브러리를 생성하기에 이상적입니다.
골든 게이트 반응 믹스를 설정하여 시작합니다. 각 PCR 제품 및 엔트리 벡터, 10X T4 Ligase 버퍼1개, Esp3I 0.5 마이크로리터, T4 리게아제 0.5 마이크로리터의 펨토몰 20개를 추가합니다. 이중 증류수를 추가하여 총 부피를 10 마이크로리터로 가져옵니다.
그런 다음 복제 반응을 실행합니다. 전체 반응 믹스를 열 충격에 의해 DH5 알파 균주 또는 동등한 대장균화학적으로 유능한 세포로 변환합니다. 밀리리터 클로람페니콜당 35 마이크로그램으로 셀을 lb 플레이트에 퍼뜨리습니다.
그런 다음 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다. 16~18시간 후, 배양기에서 플레이트를 꺼내 서퍼폴더 녹색 형광 단백질 또는 sfGFP가 더욱 강렬한 녹색 색을 위해 개발할 수 있도록 약 5시간 동안 섭씨 4도에 둡니다. 접시를 검사하려면 울트라 바이올렛 또는 블루 라이트 트랜일루미나이터에 놓습니다.
식민지를 포함하는 sfGFP는 UV 빛 의 밑에 형광할 것입니다. 녹색 식민지는 절단되지 않은 부분을 포함하기 때문에 부정적입니다. 흰색 식민지는 긍정적 일 가능성이 높습니다.
복제는 30~ 100% 흰색 식민지가 있는 경우에 성공적입니다. 왼쪽 커넥터, sfGFP 드롭아웃, 오른쪽 커넥터, 효모 선택 마커, 복제의 효모 기원 및 mRFP1, 대장균 기원 및 암피실린 내성 유전자를 가진 중간 벡터를 조립한다. 텍스트 원고에 설명된 대로 복제 반응을 수행합니다.
전체 반응 믹스를 DH5 알파 스트레인으로 변환한 다음 밀리리터 카베니실린 또는 암피실린당 50 마이크로그램으로 셀을 lb 플레이트에 전파합니다. 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 배양하십시오. 16~18시간 후에는 배양기에서 접시를 꺼낸다.
접시에는 옅은 빨간색과 옅은 녹색 식민지가 모두 포함됩니다. mRFP1및 sfGFP가 성숙하게 하기 위해 약 5시간 동안 섭씨 4도에 보관하십시오. UV 또는 청색광 트랜실루미네이터를 사용하여 잠재적으로 올바른 중간 벡터를 포함하는 녹색 식민지를 식별합니다.
lb 카베니실린 접시에 녹색 식민지를 밖으로 줄이며 하룻밤 섭씨 37도에서 배양. 다음 날, 클로람페니콜 접시에 다시 그들을 밖으로 줄이며 하룻밤 섭씨 37도에서 배양. 클로람페니콜 플레이트에서 자라는 식민지에는 잘못 조립된 플라스미드가 들어 있습니다.
중간 벡터가 성공적으로 조립되면 전사 단위를 조립합니다. 이 4피스 어셈블리에는 중간 벡터, 프로모터, CDS 및 결정자가 포함되어 있습니다. 플라스미드를 정화하고, 농도를 기록하고, 각 플라스미드를 마이크로리터당 20개의 펨토몰로 희석시다.
복제 반응을 수행한 후, 전체 복제 반응 믹스를 DH5 알파 또는 동등한 E.coli 유능한 세포로 변환하고 LBN 카베니실린에 판화한다. 그런 다음 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 접시를 배양합니다. 16~18시간 후에는 배양기에서 접시를 꺼내 서포트FP가 성숙하게 하기 위해 약 5시간 동안 섭씨 4도에서 보관하십시오.
UV 또는 청색광 트랜실루미네이터를 사용하여 잠재적으로 정확한 전사 단위를 포함하는 비형광 백색 식민지를 식별합니다. 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 다중 유전자 플라스미드에 대한 중간 벡터를 조립한다. 그런 다음 전체 복제 반응 믹스를 DH5 알파 세포로 변환하고 밀리리터 카나마이신 당 50 마이크로 그램으로 lb에 접시를 놓습니다.
하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 접시를 배양하십시오. 빨간색과 녹색 색상 기반 스크리닝을 수행한 다음, 이전에 설명한 대로 잘못된 어셈블리를 검사하기 위해 lb kanamycin 플레이트에 녹색 식민지를 줄이며 성장시다. 다음으로, 텍스트 원고에 설명된 대로 복제 반응을 설정하여 다중 유전자 플라스미드를 조립한다.
전체 복제 반응 믹스를 DH5 알파 셀로 변환하고 lb kanamycin에 접시를 놓습니다. 하룻밤 사이에 섭씨 37도에서 접시를 배양하십시오. 그런 다음 이전에 설명한 대로 녹색 및 흰색 스크리닝을 수행합니다.
이 프로토콜은 ADE2 궤적을 방해하기 위한 하나의 통합다중 유전자 플라스미드를 구성하는 데 사용되었습니다. 4개의 복제 및 1개의 통합다중 유전자 플라스미드가 조립되었다. 중간 벡터 복제에 대한 잠재적으로 정확한 콜로니의 비율은 중간 플라스미드가 복제되면 1.83%였으며, 중간으로부터 다중 유전자 플라스미드를 조립하는 성공률은 93.77%였으며, 양성 백색 식민지의 무시할 수 있는 수는 다유전자 플라스미드의 최적 조립을 나타낸다.
효모로 변신한 후, 베타 카로틴과 리코펜을 생산하는 식민지는 셋째 날에 성장했습니다. 각 접시에서 네 개의 식민지는 신선한 접시에 줄지어 이틀 더 성장했다. 카로티노이드는 UV-Vis 분광광법에 의해 추출및 정량화되었다.
BTS1/ERG20은 ERG20만으로 변형되는 것에 비해 베타 카로틴의 35배 높은 생산으로 이어집니다. 마찬가지로 리코펜의 생산은 ERG20에 비해 BTS1/ERG20의 균주에서 약 16.5배 더 높다. 다중 유전자 통합 플라스미드는 GRNA와 도우미 DNA가 없거나 gRNA및 다중 유전자 통합 플라스미드를 도우미 DNA로 사용하여 ADE2 궤적의 중단을 위해 사용되었습니다.
3~4일 후, Nourseothricin과 YPD 플레이트에서 붉은 식민지가 관찰되어 ADE2가 성공적으로 중단되었음을 나타냅니다. 이 방법을 시도하는 동안 기억해야 할 가장 중요한 것은 이 반응 믹스를 설정하는 동안 DNA 농도를 정확하게 측정하고 조심스럽게 파이펫하는 것입니다. 이 기술은 효모 신진 대사 공학 분야의 연구원들이 제품 수율을 극대화하기 위해 많은 수의 유전자와 프로모터를 조사할 수 있게 합니다.
