هذا بروتوكول مفصل لتجميع البلازميدات متعددة الجينات باستخدام مجموعة Yeast MoClo. تمكن هذه الطريقة من الاستنساخ المريح لمجموعة متنوعة من زملاء الدراسة متعددي الجينات. وهي مثالية لتوليد مكتبة كبيرة من الأجزاء ذات الصلة.
ابدأ بإعداد مزيج رد فعل البوابة الذهبية. إضافة 20 femtomoles من كل منتج PCR وناقل الدخول، ميكرولتر واحد من 10X T4 ليغاز العازلة، 0.5 ميكرولتر من Esp3I، و 0.5 ميكرولتر من T4 ligase. أضف الماء المقطر المزدوج ليصل إجمالي الحجم إلى 10 ميكرولترات.
ثم، تشغيل رد فعل الاستنساخ. تحويل مزيج التفاعل بأكمله إلى سلالة ألفا DH5 أو ما يعادلها Escherichia القولونية الخلايا المختصة كيميائيا عن طريق الصدمة الحرارية. نشر الخلايا على لوحة رطل مع 35 ميكروغرام لكل ملليلتر الكلورامفينيكول.
ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد 16 إلى 18 ساعة، أخرج اللوحة من الحاضنة واتركها عند أربع درجات مئوية لمدة خمس ساعات تقريبا للسماح للبروتين الفلوري الأخضر فائق المجلد أو sfGFP بالتطور للحصول على لون أخضر أكثر كثافة. لفحص اللوحة، ضعها على محول ترانزيوم ضوئي فوق بنفسجي أو أزرق.
وsfGFP التي تحتوي على المستعمرات فلوريس تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. المستعمرات الخضراء سلبية لأنها تحتوي على الجزء غير المصقول من البلازميد. المستعمرات البيضاء إيجابية على الأرجح.
الاستنساخ ناجح إذا كان هناك 30 إلى 100٪ مستعمرات بيضاء. تجميع ناقلات وسيطة مع الموصل الأيسر، والتسرب sfGFP، والموصل الأيمن، علامة اختيار الخميرة، أصل الخميرة من النسخ المتماثل، وplasmid جزء مع mRFP1، أصل E.coli، والجين مقاومة الأمبيسلين. إجراء رد فعل الاستنساخ كما هو موضح في المخطوطة النصية.
تحويل مزيج رد الفعل بأكمله إلى سلالة ألفا DH5 ثم نشر الخلايا على لوحة رطل مع 50 ميكروغرام لكل كاربينسيلين ملليلتر أو الأمبيسلين. احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد 16 إلى 18 ساعة، أخرج الطبق من الحاضنة.
ستحتوي اللوحة على مستعمرات حمراء شاحبة وخضراء شاحبة. يبقيه في أربع درجات مئوية لمدة خمس ساعات للسماح ل mRFP1 وsfGFP ناضجة. استخدام الأشعة فوق البنفسجية أو الضوء الأزرق transilluminator لتحديد المستعمرات الخضراء التي تحتوي على ناقلات المتوسطة الصحيحة المحتملة.
المتتالية من المستعمرات الخضراء على لوحة كاربينسيلين رطل واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، خط بها مرة أخرى على لوحة الكلورامفينيكول واحتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تحتوي المستعمرات التي تنمو على لوحات الكلورامفينيكول على بلازميدات مجمعة بشكل خاطئ.
بمجرد أن يتم تجميع المتجه الوسيط بنجاح ، تابع تجميع وحدات النسخ. يحتوي هذا التجميع من أربع قطع على المتجه الوسيط، والمروج، وCDS، والمتحديد. تنقية البلازميدات، وتسجيل تركيزاتها، وتمييع كل بلازميد إلى 20 femtomoles من الحمض النووي لكل ميكرولتر.
بعد إجراء رد فعل الاستنساخ، قم بتحويل مزيج تفاعل الاستنساخ بأكمله إلى خلايا DH5 alpha أو ما يعادلها من خلايا E.coli المختصة ولوحها على كاربينسيلين LBN. ثم احتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بعد 16 إلى 18 ساعة، أخرج الطبق من الحاضنة وابقه عند أربع درجات مئوية لمدة خمس ساعات تقريبا للسماح ل sfGFP بالنضج.
استخدم الأشعة فوق البنفسجية أو محول الضوء الأزرق لتحديد المستعمرات البيضاء غير الفلورية التي تحتوي على وحدات النسخ الصحيحة المحتملة. تجميع ناقل وسيط للأوبلازميدات متعددة الجينات كما هو موضح في مخطوطة النص. ثم تحويل مزيج رد فعل الاستنساخ بأكمله إلى خلايا ألفا DH5 ولوحة لهم على رطل مع 50 ميكروغرام لكل kanamycin ملليلتر.
احتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. إجراء فحص اللون الأحمر والأخضر القائم، ثم خط وتنمو المستعمرات الخضراء على لوحة كاناميسين رطل لفحص misassemblies كما هو موضح سابقا. بعد ذلك، قم بتجميع البلازميد متعدد الجينات عن طريق إعداد رد فعل الاستنساخ كما هو موضح في المخطوطة النصية.
تحويل مزيج رد فعل الاستنساخ بأكمله إلى خلايا ألفا DH5 ولوحة لهم على كاناميسين رطل. احتضان لوحة في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ثم إجراء الفحص الأخضر والأبيض كما هو موضح سابقا.
تم استخدام هذا البروتوكول لبناء بلازميد متكامل متعدد الجينات لتعطيل موقع ADE2. وتم تجميع أربعة بلازميدات متعددة الجينات متماثلة وواحدة متكاملة. وكانت نسبة المستعمرات الصحيحة المحتملة لاستنساخ ناقلات وسيطة 1.83٪ بمجرد استنساخ البلازميد المتوسط، وكان معدل نجاح تجميع البلازميدات متعددة الجينات من وسيطة 93.77٪الأعداد الضئيلة من المستعمرات البيضاء الإيجابية تثبت تجميع دون المستوى الأمثل من البلازميدات متعددة الجينات.
بعد التحول إلى الخميرة، نمت المستعمرات المنتجة بيتا كاروتين والليكوبين في اليوم الثالث. أربع مستعمرات من كل لوحة كانت ملطخة على لوحات جديدة ونمت لمدة يومين آخرين. تم استخراج الكاروتينات وقياسها كميا عن طريق قياس الطيف بالأشعة فوق البنفسجية.
BTS1/ERG20 يؤدي إلى 35 أضعاف إنتاج بيتا كاروتين مقارنة مع سلالة ERG20 وحدها. وبالمثل، فإن إنتاج الليكوبين هو ما يقرب من 16.5 أضعاف أعلى في سلالة مع BTS1/ERG20 بالمقارنة مع ERG20 وحدها. تم استخدام البلازميد التكاملي متعدد الجينات لتعطيل موضع ADE2 ، إما مع الحمض النووي الريبي وليس الحمض النووي المساعد أو مع الحمض النووي الريبي وplasmid التكاملي متعدد الجينات كحمض نووي مساعد.
بعد ثلاثة إلى أربعة أيام ، لوحظت المستعمرات الحمراء على لوحة YPD مع Nourseothricin ، مما يشير إلى أن ADE2 قد تعطلت بنجاح. أثناء محاولة هذه الطريقة ، فإن أهم شيء يجب تذكره هو قياس تركيزات الحمض النووي بدقة وماصة بعناية أثناء إعداد مزيج التفاعل هذا. تسمح هذه التقنية للباحثين في مجال هندسة التمثيل الغذائي الخميرة لمسح عدد كبير من الجينات والمروجين لزيادة غلة المنتج.
