Este é um protocolo detalhado para a montagem de plasmídeos multi-genes usando o kit Levedura MoClo. Este método permite a clonagem conveniente de uma variedade de colegas multi-genes. É ideal para gerar uma grande biblioteca de peças relacionadas.
Comece configurando a mistura de reação golden gate. Adicione 20 femtomoles de cada produto PCR e o vetor de entrada, um microliter de tampão 10X T4 Ligase, 0,5 microliters de Esp3I e 0,5 microliters de ligase T4. Adicione água duplamente destilada para levar o volume total a 10 microliters.
Então, execute a reação de clonagem. Transforme toda a mistura de reação na cepa alfa DH5 ou células equivalentes Escherichia coli quimicamente competentes por choque térmico. Espalhe as células em uma placa de lb com 35 microgramas por mililitro de clorofamofínico.
Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius durante a noite. Depois de 16 a 18 horas, tire a placa da incubadora e deixe-a a quatro graus Celsius por cerca de cinco horas para deixar a proteína fluorescente verde superpatos ou sfGFP se desenvolver para uma cor verde mais intensa. Para examinar a placa, coloque-a em um transilluminador de luz ultravioleta ou azul.
O sfGFP contendo colônias irá fluorescer sob a luz UV. As colônias verdes são negativas porque contêm a parte sem cortes plasmídeo. As colônias brancas são provavelmente positivas.
A clonagem é bem sucedida se houver colônias 30 a 100% brancas. Monte um vetor intermediário com o conector esquerdo, o desistência do sfGFP, o conector direito, um marcador de seleção de leveduras, uma origem levedura de replicação, e a peça plasmid com um mRFP1, uma origem E.coli e o gene resistente à ampicilina. Realize a reação de clonagem conforme descrito no manuscrito do texto.
Transforme toda a mistura de reação na cepa alfa DH5 e espalhe as células em uma placa de lb com 50 microgramas por mililitro carbenicillin ou ampicillina. Incubar a 37 graus Celsius durante a noite. Depois de 16 a 18 horas, tire a placa da incubadora.
A placa conterá colônias verdes pálidas e pálidas. Mantenha-o em quatro graus Celsius por cerca de cinco horas para deixar o mRFP1 e sfGFP amadurecer. Use um transilluminador UV ou luz azul para identificar as colônias verdes que contêm o vetor intermediário potencialmente correto.
Listrar as colônias verdes em uma placa de carbenicilina lb e incubar a 37 graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, coloque-os novamente em uma placa de clorofenicol e incubar a 37 graus Celsius durante a noite. As colônias que crescem em placas de clororamfenícol contêm plasmídeos desmontados.
Uma vez que o vetor intermediário tenha sido montado com sucesso, proceda com a montagem das unidades de transcrição. Este conjunto de quatro peças contém o vetor intermediário, um promotor, um CDS e o determinante. Purificar os plasmídeos, registrar suas concentrações e diluir cada plasmídeo a 20 femtomoles de DNA por microliter.
Depois de realizar a reação de clonagem, transforme toda a mistura de reação de clonagem em células competentes DH5 alfa ou equivalente e as emplaque na carbenicilina LBN. Em seguida, incubar a placa a 37 graus Celsius durante a noite. Depois de 16 a 18 horas, tire a placa da incubadora e mantenha-a a quatro graus Celsius por cerca de cinco horas para deixar o sfGFP amadurecer.
Use um UV ou um transilluminador de luz azul para identificar as colônias brancas não fluorescentes que contêm as unidades de transcrição potencialmente corretas. Monte um vetor intermediário para os plasmídeos multi-genes, conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, transforme toda a mistura de reação de clonagem em células alfa DH5 e emplaque-as em lb com 50 microgramas por mililitro kanamycin.
Incubar a placa a 37 graus Celsius durante a noite. Realize a triagem baseada em cores vermelhas e verdes, em seguida, listrar e crescer as colônias verdes em uma placa de kanamicina lb para tela para misassemblies como demonstrado anteriormente. Em seguida, monte o plasmídeo multi-gene, configurando uma reação de clonagem como descrito no manuscrito do texto.
Transforme toda a mistura de reação de clonagem em células alfa DH5 e emplaque-as na kanamicina lb. Incubar a placa a 37 graus Celsius durante a noite. Em seguida, realize a triagem verde e branca como descrito anteriormente.
Este protocolo foi usado para construir um plasmídeo integrativo multi-gene para interromper o lócus ADE2. Quatro plóides multi-genes replicativos e um integrativo foram montados. A razão de colônias potencialmente corretas para a clonagem vetorial intermediária foi de 1,83% Uma vez clonada a plasmida intermediária, a taxa de sucesso da montagem de plasmídeos multi-genes do intermediário foi de 93,77% O número insignificante de colônias brancas positivas demonstram um conjunto subótimo de plóides multi-genes.
Depois de se transformarem em levedura, colônias que produzem betacaroteno e licopeno cresceram no terceiro dia. Quatro colônias de cada prato foram listradas em placas frescas e cultivadas por mais dois dias. Os carotenoides foram extraídos e quantificados pela espectrofotometria UV-Vis.
O BTS1/ERG20 leva a uma produção 35 vezes maior de betacaroteno em comparação com a cepa apenas com ORG20. Da mesma forma, a produção de licopeno é aproximadamente 16,5 vezes maior na cepa com BTS1/ERG20 em comparação apenas com ERG20. O plasmídeo integrativo multi-gene foi usado para a interrupção do lócus ADE2, seja com um gRNA e sem DNA de ajudante ou com gRNA e um plasmídeo integrativo multi-gene como DNA auxiliar.
Após três a quatro dias, colônias vermelhas foram observadas na placa YPD com Nourseothricin, indicando que a ADE2 havia sido interrompida com sucesso. Ao tentar este método, a coisa mais importante a se lembrar é medir as concentrações de DNA com precisão e pipeta cuidadosamente ao configurar essa mistura de reação. Essa técnica permite que pesquisadores da área de Engenharia Metabólica de Leveduras orientem um grande número de genes e promotores para o rendimento maximizado do produto.
