Это подробный протокол для сборки много генных плазмидов с использованием комплекта Дрожжевой MoClo. Этот метод позволяет удобно клонировать различных много генных одноклассников. Он идеально подходит для создания большой библиотеки связанных частей.
Начните с создания смеси реакции Золотые Ворота. Добавьте 20 фемтомолов каждого продукта PCR и вектор входа, один микролитр буфера 10X T4 Ligase, 0,5 микролитров Esp3I и 0,5 микролитров T4 лигазы. Добавьте двойную дистиллированную воду, чтобы довести общий объем до 10 микролитров.
Затем запустите реакцию клонирования. Превратите всю смесь реакции в штамм DH5 альфа или эквивалент Escherichia coli химически компетентных клеток теплового удара. Распространение клеток на пластине фунта с 35 микрограммов на миллилитр хлорамфеникол.
Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в одночасье. После 16 до 18 часов, возьмите пластину из инкубатора и оставить его при четырех градусах по Цельсию в течение примерно пяти часов, чтобы суперфолдер зеленый флуоресцентный белок или sfGFP развиваться для более интенсивного зеленого цвета. Чтобы экран пластины, поместите его на ультрафиолетовый или синий свет трансиллюминатора.
SFGFP, содержащий колонии, будет флуоресцеть под ультрафиолетовым светом. Зеленые колонии являются отрицательными, потому что они содержат необрезанные части плазмиды. Белые колонии, вероятно, положительные.
Клонирование успешно, если есть от 30 до 100% белых колоний. Соберите промежуточный вектор с левым разъемом, отсева SFGFP, правый разъем, маркер выбора дрожжей, дрожжевой происхождения репликации, и часть плазмид с mRFP1, E.coli происхождения, и ампициллин устойчивый ген. Выполните реакцию клонирования, описанную в текстовой рукописи.
Преобразуйте всю смесь реакции в штамм DH5 альфа затем распространение клеток на пластине фунта с 50 микрограммов на миллилитр карбенициллин или ампициллин. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию за одну ночь. Через 16-18 часов вывехив тарелку из инкубатора.
Пластина будет содержать как бледно-красные, так и бледно-зеленые колонии. Держите его на четыре градуса по Цельсию в течение примерно пяти часов, чтобы mRFP1 и sfGFP созреть. Используйте УФ или синий свет трансиллюминатор для определения зеленых колоний, которые содержат потенциально правильный промежуточный вектор.
Streak из зеленых колоний на фунт карбенициллин пластины и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье. На следующий день, полоса их снова на пластине хлорамфеникол и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в одночасье. Колонии, растущие на пластинах хлорамфеникол, содержат неправильно собранную плазмиду.
После успешной сборки промежуточного вектора приступить к сборке транскрипционных блоков. Эта сборка из четырех частей содержит промежуточный вектор, промоутер, CDS и детерминатор. Очищать плазмиды, записывать их концентрации и разбавлять каждую плазмиду до 20 фемтомолов ДНК на микролитер.
После выполнения реакции клонирования, трансформировать всю смесь реакции клонирования в DH5 альфа или эквивалент E.coli компетентных клеток и пластины их на LBN карбенициллин. Затем инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в одночасье. После 16 до 18 часов, возьмите пластину из инкубатора и держать его на четыре градуса по Цельсию в течение примерно пяти часов, чтобы SFGFP созреть.
Используйте УФ или синий свет трансиллюминатор для выявления нефлуоресцентных белых колоний, которые содержат потенциально правильные единицы транскрипции. Соберите промежуточный вектор много генных плазмидов, описанных в текстовой рукописи. Затем преобразуйте всю смесь реакции клонирования в альфа-клетки DH5 и почините их на фунт 50 микрограммами на миллилитр канамицин.
Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в одночасье. Выполните красный и зеленый цвет на основе скрининга, а затем полоса и расти зеленые колонии на фунт kanamycin пластины для экрана для misassemblies, как это было продемонстрировано ранее. Затем соберите много генную плазмиду, установив реакцию клонирования, описанную в текстовой рукописи.
Преобразуйте всю смесь реакции клонирования в альфа-клетки DH5 и почините их на lb канамицине. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в одночасье. Затем выполните зеленый и белый скрининг, как описано ранее.
Этот протокол был использован для построения одной интегративной многогенерной плазмиды для нарушения локуса ADE2. Было собрано четыре репликационные и одна интегративная много генная плазмида. Соотношение потенциально правильных колоний для клонирования промежуточного вектора составило 1,83%После клонирования промежуточной плазмиды, успешность сборки много генных плазмидов из промежуточных составила 93,77%Незначительное количество положительных белых колоний демонстрируют неоптиманую сборку много генных плазмидов.
После превращения в дрожжи, колонии, производящие бета-каротин и ликопин, выросли на третий день. Четыре колонии из каждой тарелки были вылезли на свежие тарелки и росли еще два дня. Каротиноиды были извлечены и количественно УФ-Vis спектрофотометрии.
BTS1/ERG20 приводит к 35 раза более высокому производству бета-каротина по сравнению с штаммом только с ERG20. Аналогичным образом, производство ликопина примерно в 16,5 раза выше в штамме с BTS1/ERG20 по сравнению с ERG20 в одиночку. Много генная интегративная плазмида использовалась для нарушения локуса ADE2, либо с гРНК и без ДНК-помощника, либо с гРНК и много генной интегративной плазмидой в качестве помощника ДНК.
Через три-четыре дня на пластине YPD наблюдались красные колонии с юрсеодрицином, что указывает на то, что ADE2 был успешно нарушен. При попытке этого метода, самое главное помнить, чтобы измерить концентрации ДНК точно и пипетки тщательно при настройке этой реакции смеси. Этот метод позволяет исследователям в области дрожжевой метаболической инженерии для обследования большого количества генов и промоутеров для максимального урожайности продукта.
