Il s’agit d’un protocole détaillé pour l’assemblage de plasmides multigéniques à l’aide du kit Yeast MoClo. Cette méthode permet le clonage pratique d’une variété de camarades de classe multi-gènes. Il est idéal pour générer une grande bibliothèque de pièces connexes.
Commencez par mettre en place le mélange de réaction Golden Gate. Ajoutez 20 femtomoles de chaque produit PCR et le vecteur d’entrée, un microlitre de tampon Ligase 10X T4, 0,5 microlitres d’Esp3I et 0,5 microlitre de ligase T4. Ajouter de l’eau à double distillation pour porter le volume total à 10 microlitres.
Ensuite, exécuter la réaction de clonage. Transformez l’ensemble du mélange de réaction en souche alpha DH5 ou en cellules escherichia coli équivalentes chimiquement compétentes par choc thermique. Étendre les cellules sur une plaque de lb avec 35 microgrammes par chloramphénicol millilitre.
Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après 16 à 18 heures, sortez la plaque de l’incubateur et laissez-la à quatre degrés Celsius pendant environ cinq heures pour laisser la protéine fluorescente verte superfolder ou sfGFP se développer pour une couleur verte plus intense. Pour filtrer la plaque, placez-la sur un transilluminateur ultra-violet ou bleu clair.
Le sfGFP contenant des colonies fluore sous la lumière UV. Les colonies vertes sont négatives parce qu’elles contiennent la partie non coupée plasmide. Les colonies blanches sont probablement positives.
Le clonage est réussi s’il y a des colonies 30 à 100% blanches. Assembler un vecteur intermédiaire avec le connecteur gauche, le décrochage sfGFP, le connecteur droit, un marqueur de sélection de levure, une origine de levure de réplication, et la partie plasmide avec un mRFP1, une origine E.coli, et le gène résistant à l’ampicilline. Effectuez la réaction de clonage telle que décrite dans le manuscrit du texte.
Transformez l’ensemble du mélange de réaction en souche ALPHA DH5 puis étalez les cellules sur une plaque de lb avec 50 microgrammes par carbenicilline millilitre ou ampicilline. Incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après 16 à 18 heures, sortir la plaque de l’incubateur.
La plaque contiendra à la fois des colonies rouge pâle et vert pâle. Gardez-le à quatre degrés Celsius pendant environ cinq heures pour laisser le mRFP1 et sfGFP mûrir. Utilisez un transilluminateur uv ou bleu clair pour identifier les colonies vertes qui contiennent le vecteur intermédiaire potentiellement correct.
Strié les colonies vertes sur une plaque de carbenicilline lb et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, stries à nouveau sur une plaque de chloramphéniphénol et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Les colonies qui poussent sur des plaques de chloramphénicol contiennent des plasmides mal assemblés.
Une fois que le vecteur intermédiaire a été assemblé avec succès, procéder à l’assemblage des unités de transcription. Cet assemblage de quatre pièces contient le vecteur intermédiaire, un promoteur, un CDS et un déterminateur. Purifier les plasmides, enregistrer leurs concentrations, et diluer chaque plasmide à 20 femtomoles d’ADN par microlitre.
Après avoir effectué la réaction de clonage, transformer l’ensemble du mélange de réaction de clonage en cellules compétentes DH5 alpha ou équivalent e.coli et les plaquer sur la carbenicilline LBN. Puis incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après 16 à 18 heures, sortez la plaque de l’incubateur et gardez-la à quatre degrés Celsius pendant environ cinq heures pour laisser le fpSG mûrir.
Utilisez un uv ou un transilluminateur de lumière bleue pour identifier les colonies blanches non fluorescentes qui contiennent les unités de transcription potentiellement correctes. Assembler un vecteur intermédiaire pour les plasmides multigéniques tel que décrit dans le manuscrit du texte. Transformez ensuite l’ensemble du mélange de réaction de clonage en cellules alpha DH5 et plaquez-les sur lb avec 50 microgrammes par kanamycine millilitre.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Effectuez le criblage rouge et vert basé sur la couleur, puis striez et cultivez les colonies vertes sur une plaque de kanamycine de lb pour dépister les erreurs d’assemblage comme démontré précédemment. Ensuite, assemblez le plasmide multigénique en mettant en place une réaction de clonage telle que décrite dans le manuscrit du texte.
Transformez l’ensemble du mélange de réaction de clonage en cellules alpha DH5 et plaquez-les sur de la lb kanamycine. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Effectuez ensuite le criblage vert et blanc tel qu’il a été décrit précédemment.
Ce protocole a été utilisé pour construire un plasmide multigénique intégratif pour perturber le locus ADE2. Quatre plasmides multigéniques réplicateurs et un integrative ont été assemblés. Le rapport des colonies potentiellement correctes pour le clonage vectoriel intermédiaire était de 1,83 %Une fois que le plasmide intermédiaire a été cloné, le taux de réussite de l’assemblage de plasmides multigéniques de l’intermédiaire était de 93,77 %Les nombres négligeables de colonies blanches positives démontrent un assemblage sous-optimal de plasmides multigéniques.
Après s’être transformées en levure, les colonies produisant du bêta-carotène et du lycopène ont grandi le troisième jour. Quatre colonies de chaque assiette ont été striées sur des assiettes fraîches et cultivées pendant deux jours de plus. Les caroténoïdes ont été extraits et quantifiés par spectrophotométrie UV-Vis.
BTS1/ERG20 conduit à une production 35 fois plus élevée de bêta-carotène par rapport à la souche avec ERG20 seul. De même, la production de lycopène est environ 16,5 fois plus élevée dans la souche BTS1/ERG20 que dans le seul ERG20. Le plasmide intégrateur multigénique a été utilisé pour la perturbation du locus ADE2, soit avec un ADN gRNA et sans ADN d’aide ou avec l’ARN et un plasmide intégrateur multigénique comme ADN d’aide.
Après trois à quatre jours, des colonies rouges ont été observées sur la plaque de YPD avec nourseothricin, indiquant qu’ADE2 avait été avec succès perturbé. Tout en essayant cette méthode, la chose la plus importante à retenir est de mesurer les concentrations d’ADN avec précision et pipette soigneusement tout en mettant en place ce mélange de réaction. Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de l’ingénierie métabolique de levure d’arpenter un grand nombre de gènes et de promoteurs pour maximiser le rendement du produit.
