זהו פרוטוקול מפורט להרכבת פלסמידים מרובי גנים באמצעות ערכת שמרים MoClo. שיטה זו מאפשרת שיבוט נוח של מגוון חברים לכיתה מרובי גנים. הוא אידיאלי ליצירת ספרייה גדולה של חלקים קשורים.
התחל על ידי הגדרת תערובת התגובה של שער הזהב. הוסף 20 femtomoles של כל מוצר PCR ואת וקטור הכניסה, microliter אחד של מאגר ליגאז 10X T4, 0.5 microliters של Esp3I, ו 0.5 microliters של ליגאז T4. הוסיפו מים מזוקקים כפולים כדי להביא את הנפח הכולל ל-10 מיקרוליטרים.
לאחר מכן, הפעל את תגובת השיבוט. להפוך את תערובת התגובה כולה לתוך זן אלפא DH5 או שווה ערך Escherichia coli תאים כימיים מוסמכים על ידי הלם חום. מורחים את התאים על צלחת ליברות עם 35 מיקרוגרם למיליליטר כלוראמפניקול.
ואז להדגיר את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר 16 עד 18 שעות, מוציאים את הצלחת מהחממה ומשאירים אותה בארבע מעלות צלזיוס למשך כחמש שעות כדי לאפשר לחלבון הפלואורסצנטי הירוק או ל- sfGFP להתפתח לצבע ירוק אינטנסיבי יותר. כדי לסנן את הצלחת, הנח אותה על טרנסילומינטור אולטרה סגול או כחול.
SfGFP המכיל מושבות יהיה פלואורסצנטי תחת אור UV. המושבות הירוקות שליליות משום שהן מכילות את החלק הלא מלוטש פלסמיד. המושבות הלבנות הן כנראה חיוביות.
השיבוט יצליח אם יש 30 עד 100% מושבות לבנות. להרכיב וקטור ביניים עם המחבר השמאלי, נשירה sfGFP, המחבר הימני, סמן בחירת שמרים, מקור שמרים של שכפול, ואת החלק plasmid עם mRFP1, מקור E.coli, ואת הגן עמיד אמפילין. בצע את תגובת השיבוט כמתואר בכתב היד של הטקסט.
להפוך את תערובת התגובה כולה לתוך זן אלפא DH5 ואז להפיץ את התאים על צלחת lb עם 50 מיקרוגרם לכל מיליליטר קרבניצילין או אמפיצילין. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר 16 עד 18 שעות, מוציאים את הצלחת מהחממה.
הצלחת תכיל מושבות אדומות חיוורות וירוקות חיוורות. שמור את זה על ארבע מעלות צלזיוס במשך כחמש שעות כדי לאפשר mRFP1 ו sfGFP להתבגר. השתמש טרנסילומינטור UV או אור כחול כדי לזהות את המושבות הירוקות המכילות וקטור ביניים פוטנציאל נכון.
פסים את המושבות הירוקות על צלחת קרבניצילין lb והדגירה ב 37 מעלות צלזיוס לילה. למחרת, פס אותם שוב על צלחת כלוראמפניקול ודגר ב 37 מעלות צלזיוס לילה. המושבות הגדלות על לוחות כלוראמפניקול מכילות פלסמידים שהורמסו שלא כהלכה.
לאחר שווקטור הביניים הורכב בהצלחה, המשך בהרכבת יחידות התמלול. הרכבה זו בת ארבעת החלקים מכילה את וקטור הביניים, מקדם, תקליטור ודטרקטור. לטהר את הפלסמידים, לתעד את הריכוזים שלהם, ולדלל כל פלסמיד ל 20 femtomoles של DNA לכל מיקרוליטר.
לאחר ביצוע תגובת השיבוט, להפוך את כל תערובת תגובת שיבוט לתוך אלפא DH5 או שווה ערך E.coli תאים מוסמכים צלחת אותם על קרבניצילין LBN. ואז להדגיר את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר 16 עד 18 שעות, מוציאים את הצלחת מהחממה ושומרים אותה על ארבע מעלות צלזיוס למשך כחמש שעות כדי לאפשר ל- sfGFP להתבגר.
השתמש UV או transilluminator אור כחול כדי לזהות את המושבות הלבנות שאינן פלואורסצנטיות המכילות את יחידות שעתוק פוטנציאל נכון. להרכיב וקטור ביניים עבור פלסמידים מרובי גנים כמתואר בכתב היד טקסט. לאחר מכן להפוך את כל תערובת תגובת שיבוט לתוך תאי אלפא DH5 צלחת אותם על lb עם 50 מיקרוגרם למיליליטר kanamycin.
דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. בצע הקרנה מבוססת צבע אדום וירוק, ולאחר מכן פס ולהגדיל את המושבות הירוקות על צלחת kanamycin lb כדי למסך עבור הרכבות שגויות כפי שהוכח קודם לכן. לאחר מכן, להרכיב את פלסמיד רב גנים על ידי הגדרת תגובת שיבוט כמתואר בכתב היד טקסט.
להפוך את כל תערובת תגובת שיבוט לתוך תאי אלפא DH5 צלחת אותם על lb kanamycin. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס לילה. לאחר מכן בצע את ההקרנה בירוק ולבן כפי שתואר קודם לכן.
פרוטוקול זה שימש לבניית פלסמיד רב-גנים אינטגרטיבי אחד לשיבוש מוקד ADE2. ארבעה פלסמידים משוכפלים ואחד רב-גנים אינטגרטיבי הורכבו. היחס בין מושבות שעשויות להיות נכונות לשיבוט וקטור הביניים היה 1.83% לאחר שפלסמיד הביניים שוכפל, שיעור ההצלחה של הרכבת פלסמידים מרובי גנים מהבינוניים היה 93.77% המספרים הזניחים של מושבות לבנות חיוביות מדגימים הרכבה תת-אופטימלית של פלסמידים מרובי גנים.
לאחר שהפכו לשמרים, מושבות המייצרות בטא קרוטן וליקופן גדלו ביום השלישי. ארבע מושבות מכל צלחת היו מפוספסות על צלחות טריות וגדלו במשך יומיים נוספים. הקרוטנואידים חולצו וכומתו על ידי ספקטרופוטומיית UV-Vis.
BTS1/ERG20 מוביל לייצור גבוה פי 35 של בטא קרוטן בהשוואה למתח עם ERG20 בלבד. כמו כן, הייצור של ליקופן הוא כ 16.5 קיפול גבוה יותר בזן עם BTS1/ERG20 לעומת ERG20 לבד. הפלסמיד האינטגרטיבי הרב-גנים שימש לשיבוש מוקד ADE2, בין אם עם gRNA ובין אם ללא דנ"א עוזר או עם gRNA ופלסמיד אינטגרטיבי מרובה גנים כדנ"א עוזר.
לאחר שלושה עד ארבעה ימים, מושבות אדומות נצפו על לוחית YPD עם Nourseothricin, המציין כי ADE2 שובש בהצלחה. בעת ניסיון שיטה זו, הדבר החשוב ביותר לזכור הוא למדוד את ריכוזי ה- DNA במדויק פיפטה בזהירות בעת הגדרת תערובת תגובה זו. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים בתחום ההנדסה המטבולית שמרים לסקר מספר רב של גנים ויחצנים עבור תפוקת מוצר מקסימלית.
