Este método se puede utilizar para detectar con precisión y facilidad la expresión de proteínas objetivo en el corazón del pez cebra. El cambio en la proteína diana se detecta directamente midiendo la inmunofluorescencia. Realizar la recolección y el tratamiento de embriones de pez cebra, como se describe en el texto manuscrito.
A las 72 horas después de la fertilización, transfiera los embriones a portaobjetos de vidrio y obsérquelos bajo un microscopio estereoscópico. Registre malformaciones cardíacas, como edema pericárdico, alteración del bucle y disminución del tamaño. Calcule las tasas de malformación y analice las diferencias entre los grupos utilizando ANOVA unidireccional, seguido de la prueba de comparación múltiple de Turquía.
Después de anestesiar los embriones con 0,6 miligramos por mililitro MS222, registre los latidos del corazón durante 30 segundos y cuantifique las frecuencias cardíacas utilizando el software Image J. Diseccione cuidadosamente los corazones de los embriones de pez cebra con una aguja de jeringa desechable bajo un microscopio estereoscópico. Use una pluma de barrera hidrofóbica para dibujar un círculo en un portaobjetos de vidrio limpio.
Agregue 50 microlitros de paraformaldehído al 4% a 1,25 microlitros de PBS para hacer una solución fijadora, luego coloque tres corazones disecados en un círculo de barrera hidrofóbico e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Decantar la solución bajo el microscopio y secar las muestras a temperatura ambiente durante al menos cinco minutos. Lave los portaobjetos tres veces en PBST durante cinco minutos por lavado.
Agregue 50 microlitros de BSA a 1, 000 microlitros de PBST para obtener una solución de BSA al 5%, e incube los portaobjetos en una cámara húmeda durante una hora para bloquear la unión de anticuerpos no específicos. Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado. Diluir dos microlitros de anticuerpo monoclonal de ratón contra 8-hidroxidesoxiguanosina y dos microlitros de anticuerpo policlonal de conejo contra gamma-H2AX en 296 microlitros de PBST para obtener una solución de cóctel de anticuerpos primarios en funcionamiento.
Incubar las muestras de corazón con 50 microlitros de la solución de cóctel de anticuerpos primarios en una cámara humidificada durante al menos una hora a temperatura ambiente o durante la noche a cuatro grados centígrados. Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBST durante cinco minutos por lavado. Diluya un microlitro de anticuerpo secundario anti-ratón de cabra marcado con FITC y un microlitro de anticuerpo secundario anti-conejo de cabra psy-3 en 500 microlitros de PBST para obtener una solución de cóctel de anticuerpos secundarios en funcionamiento.
Incubar las muestras con los anticuerpos secundarios durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Decantar la solución y lavar las muestras tres veces con PBS durante cinco minutos por lavado. Agregue 20 microlitros de DAPI a las muestras para la tinción nuclear e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Aplique un resbalón de cubierta al portaobjetos y séllelo con esmalte de uñas para evitar el secado y el movimiento. Imagine las muestras bajo un microscopio de fluorescencia y cuantifique la señal fluorescente del área del corazón utilizando el software ImageJ. Calcule los cambios relativos utilizando el promedio de las muestras de control DMSO y determine la significación estadística de los datos.
Los embriones expuestos a PM 2.5 en ausencia o presencia del antioxidante, N-acetil-L-cisteína, o NAC, fueron evaluados para detectar la presencia de malformaciones cardíacas. La OMA de PM 2.5 costó un aumento significativo en la teratogénesis cardíaca, como edema pericárdico, asa alterada y disminución del tamaño, en comparación con los corazones tratados con DMSO-control. La frecuencia cardíaca también disminuyó significativamente en embriones expuestos a la OMA.
Adición de defectos cardíacos inducidos por la OMA atenuada por NAC. Se utilizó un ensayo de inmunofluorescencia para evaluar el alcance del daño en el ADN en los tejidos tratados con OMA. Los niveles de 8-hidroxidesoxiguanosina y la expresión de gamma-H2AX aumentaron significativamente en los corazones de embriones de pez cebra tratados con EOM, lo que indica un aumento en el daño oxidativo del ADN y las roturas de doble cadena de ADN, respectivamente.
El daño del ADN inducido por la OMA fue parcialmente contrarrestado por la suplementación con NAC. Al intentar este protocolo, tenga cuidado al lavar las muestras con PBS, ya que el corazón del pez cebra puede desprenderse del portaobjetos.
