Nuestro protocolo presenta una herramienta optimizada para estudiar el corazón del pez cebra in vivo y describe las técnicas de inmovilización de incrustación junto con la adquisición de datos y la tubería de análisis para imágenes cardíacas. El pez cebra es un sistema modelo cardíaco con un gran potencial para aplicaciones como la detección de drogas. Los protocolos que permiten imágenes suaves en condiciones fisiológicas son cruciales cuando se estudian las enfermedades cardíacas.
El flujo de trabajo presentado aquí se centra en las imágenes del corazón embrionario del pez cebra, pero se puede aplicar una versión modificada a varias otras muestras y experimentos, incluidos calamares, gusanos e hidras. Comience por recolectar los embriones obtenidos de la reproducción de las líneas transgénicas deseadas. Mantenga los embriones a 28 grados centígrados en una placa de Petri llena de medio de pescado E3.
Use una aguja de vidrio perforada montada en un micromanipulador y conectada a un inyector pico para inyectar 30 picogramos de ARNm de alfa-bungarotoxina en la yema de uno o dos embriones en etapa celular para inmovilizar a los peces. Mantenga los huevos a 28 grados centígrados en una placa de Petri llena de medio E3, y transfiera los huevos cada 24 horas a una nueva placa que contenga medio E3 fresco hasta la toma de imágenes. Para prevenir la formación de pigmento, si el fondo del pez cebra no es albino, transfiera el pescado a las 25 horas después de la fertilización a un nuevo plato que contenga medio E3 con 0.2 milimol tirosinasa inhibidor 1-fenil 2-tiourea, también conocido como PTU.
Para enderezar el tubo de etileno propileno fluorado, coloque el tubo en un tubo seguro para autoclave de vidrio o acero con el diámetro interior correcto para que se ajuste a los tubos de polímero y el autoclave a 180 grados Celsius durante dos horas. Una vez que los tubos alcancen la temperatura ambiente, retire el tubo de polímero enderezado. Para limpiar el tubo, use una jeringa de 50 milímetros para enjuagar el tubo dos veces con un molar de hidróxido de sodio.
Corte el tubo al tamaño de un tubo centrífugo de 50 mililitros, colóquelo en un tubo de centrífuga lleno de 0.5 molares de hidróxido de sodio y ultrasonido durante 10 minutos. Enjuague el tubo de etileno propileno fluorado con agua destilada doble, seguido de etanol al 70%. Tubos de transferencia Un tubo de centrífuga fresco contenía 70% de etanol y ultrasonido durante 10 minutos.
Después de la ultrasonicación, enjuague el tubo por última vez con agua destilada doble y guárdelo en un tubo de centrífuga que contenga agua destilada doble. Después de disolver la agarosa de bajo punto de fusión en medio E3, vierta la agarosa derretida en una placa de Petri de vidrio o plástico para hacer una capa de uno a dos milímetros. Una vez que la agarosa esté solidificada, vierta suavemente el medio E3 sobre el agar para evitar el secado.
Selle la placa con película de parafina y guárdela a cuatro grados centígrados. Descongele la solución madre de tricaína y agregue 0.02% de tricaína al medio E3 sin azul de metilo para usar como medio de incrustación. Use una pipeta de vidrio desechable para transferir el pescado al medio de incrustación.
Verifique que el pez haya dejado de moverse y que el corazón lata a una velocidad similar en comparación con el control. Corte el tubo de etileno propileno fluorado a la longitud ideal con una cuchilla de afeitar. Prepare una jeringa con una cánula de extremo romo.
Llene la jeringa con aire, luego monte el tubo en la aguja y elimine suavemente el agua restante vaciando la jeringa. A continuación, llene el tubo de etileno propileno fluorado montado en una jeringa con medios. Inserte un embrión en el tubo, manteniendo la cabeza del pez cerca del extremo del tubo, evitando la formación de burbujas.
Con una cuchilla de afeitar, corte cuidadosamente el tubo en el borde de la cánula o aguja del extremo romo. Después de desechar cualquier líquido en la parte superior del plato recubierto de agar, sumerja el tubo directamente en el agar. Gire el tubo y sáquelo para liberar el tapón de la cama de agarosa.
Verifique la presencia del tapón de agar en el extremo del tubo. Para obtener imágenes a largo plazo, corte de tres a cinco orificios en el tubo en cada dirección cardinal, al menos cinco milímetros por encima del extremo del pez colocando una cuchilla de afeitar perpendicular al eje del tubo y haga una incisión en el tubo a 30 grados hasta llegar al medio de montaje. Luego, haga una segunda incisión a 180 grados para crear un orificio y enrolle el tubo para visualizar los cortes con claridad.
Transfiera el embrión montado a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contenga medios de incrustación hasta que esté listo para la imagen. Monte el tubo en el soporte de la muestra y llene la cámara de imágenes con medios de incrustación. Coloque el soporte de la muestra en el escenario con la muestra sumergiéndose en la cámara.
Verifique la salud de los peces incrustados evaluando visualmente la frecuencia cardíaca y, si el latido del corazón es demasiado lento, deseche la muestra. Utilice siempre la misma posición de la muestra para obtener imágenes reproducibles y gire los peces para que ambos ojos estén en el plano focal. Luego, gire el pez aproximadamente de 20 a 30 grados en sentido contrario a las agujas del reloj durante 48 horas después de la fertilización.
Cuando el pez se haya adaptado a la potencia del láser, seleccione el lado de iluminación que le brinde la mejor calidad de imagen. En cada plano Z, grabe de cuatro a cinco latidos cardíacos a 300 fotogramas por segundo, o más. Para registrar el latido del corazón, mueva la muestra paso a paso a través de la hoja de luz y use un espaciado Z de uno a dos micrómetros para cubrir toda la profundidad del corazón.
Cargue el archivo 4D en un software de renderizado 3D para explorar los datos y generar películas del corazón de pez cebra renderizado. A las 48 horas después de la fertilización, el corazón acaba de someterse a un bucle y tiene dos cámaras, el ventrículo y la aurícula, pero aún no ha desarrollado las válvulas. Las diferentes estructuras cardíacas como el ventrículo, el canal auriculoventricular, la aurícula, el tracto de entrada y el tracto de salida son fácilmente distinguibles.
Los datos indicaron latidos precisos y revelaron interacciones complejas entre las dos capas celulares del corazón, el miocardio, una capa muscular de una sola célula que se contrae y genera fuerza, y el endocardio, una capa de una sola célula que conecta el corazón con la vasculatura. Lo más importante es verificar siempre la salud de la muestra y los latidos cardíacos consistentes bajo un estereoscopio. Si bien las técnicas convencionales a menudo afectan la forma o función del corazón, nuestros métodos nos brindan datos dinámicos e imperturbables del corazón que late que nos ayudan a comprender lo esencial del corazón embrionario temprano.
