O protocolo optogenético padronizado é projetado para laboratórios interessados em usar a luz como estímulo para controlar propriedades celulares em sistemas de células de mamíferos projetados. Este protocolo é fácil de implementar em laboratórios de outra forma não familiarizados com a optogenética e fornece métodos para controle temporal espacial preciso de sistemas biológicos projetados. Este método tem uma ampla gama de aplicação em áreas específicas de pesquisa onde informações espáteis podem ser importantes, incluindo biologia do câncer, biologia de sistemas e diferenciação de tecidos.
Para começar, selecione os componentes genéticos para combinar a ligação em um único circuito genético ou plasmídeo. Por exemplo, locais de integração de DNA de mamíferos, elementos responsivos à luz ou genes funcionais. Depois de montar e examinar todas as características necessárias, como códons inicisos, sequências regulatórias ou traduzidas, use qualquer software de engenharia genética e clonagem molecular, anote e armazene as sequências de DNA para uso posterior e como referência.
Valide os primers computacionalmente para construção plasmid através dos recursos de software de clonagem molecular incorporado, por exemplo, alinhamento de sequência. Para gerar uma linha celular estável, transfem os circuitos genéticos de design e as células desejadas usando uma mistura lipossa do DNA do circuito genético com recombinase apropriada. Depois que as células forem 80 a 100% confluentes, congele as células em uma mistura de mídia 45% antiga, mídia 45% fresca e 10% DMSO.
Transfira as células restantes para um tubo estéril e realize uma triagem unicelular para isolar células monoclonais em uma placa de 96 poços. Cerca de duas a três semanas após a classificação monoclonal, os poços dentro da placa de 96 poços devem ter focos. Quando 50 a 60% de confluência for alcançada, divida as células em uma placa de 12 poços.
Adicione o firmware ao circuito LPA montado usando um programador de microcontrolador. Em seguida, misture peças impressas em 3D na placa de circuito montada usando a placa de montagem, a placa de circuito, o espaçador led, o adaptador de placa, uma placa de 24 poços, uma tampa de placa, parafusos de montagem, porcas de asa e componentes de empilhamento. Para iniciar um experimento optogenético, use o software Iris disponível no site do Tabor Lab para programar um cartão SD para o LPA e explorar condições de luz apropriadas.
Em seguida, insira valores de intensidade com as réplicas técnicas para o contorno experimental desejado. Adicione cerca de 75.000 células por poço em uma placa preta de 24 poços em um volume total de 500 microliters, em seguida, coloque as células em uma incubadora umidificada com 5% de dióxido de carbono para permitir que elas se contentem por duas a seis horas. Depois de transferir as células da capa de cultura tecidual no final da incubação, remova a tampa plástica e adicione uma tira de papel alumínio adesiva ao topo da placa para minimizar a transferência de luz entre os poços para que a luz só possa entrar através do LED localizado na parte inferior do poço.
Coloque a placa nas partes 3D instaladas do LPA e cubra a placa com a tampa LPA impressa em 3D que se encaixa sobre os parafusos do dispositivo em cada canto. Conecte o dispositivo à fonte de alimentação e pressione o botão de reset no dispositivo LPA para garantir que as configurações atualizadas do experimento LPA sejam aplicadas e incubar as células. Após a incubação, dentro da capa de cultura tecidual, retire a tira de papel alumínio da placa e deixe a placa sentar por um a dois minutos para evitar que a condensação se forme na tampa plástica.
Em seguida, coloque a tampa de plástico original de volta na placa e imagem das células com o contraste de fase apropriado ou microscópio de fluorescência. Após 24 a 72 horas após a indução, seguido de experimentação, transfira todo o conteúdo de cada poço de cerca de 500 microliters para os tubos rotulados equipados com o coador de células. Em seguida, usando o software de instrumento de citometria de fluxo apropriado, crie um portão de dispersão para frente e lateral para capturar as células únicas do tamanho e granularidade apropriadas para excluir detritos e aglomerados celulares.
Uma vez que o portão esteja definido, capture aproximadamente 10.000 células com o portão apropriado e ajuste o número da célula dependendo da quantidade de dados celulares necessários e repita a captura de células experimentais em cada tubo. Após a indução e a trippsinização, transfira todo o conteúdo de cada poço de cerca de 500 microliters para os tubos rotulados. Centrifugar as células por cinco minutos a 400 vezes G.Depois de descartar o supernante, mova as amostras para um capô de fumaça química.
Resuspense as células em 750 a 1.000 microlitres de 4%PFA diluídos em PBS e pipeta para cima e para baixo várias vezes para quebrar os aglomerados celulares. Após 15 minutos de incubação, adicione 750 a 1.000 microliters de PBS e novamente pipeta para cima e para baixo várias vezes, em seguida, pelota para baixo as células por cinco minutos a 400 vezes G à temperatura ambiente. Depois de descartar o supernante, mova as amostras para um capô de fumaça química e resuspenque as células em 750 a 1.000 microliters de metanol gelado como demonstrado e permita que as células se sentem por 30 minutos em um congelador de menos 20 graus Celsius.
Após a incubação, adicione 750 a 1.000 microliters de PBS enquanto estiver subindo e descendo várias vezes. Em seguida, depois de centrifugar as células por cinco minutos a 400 vezes G, descarte o supernante e mova as amostras para um capô de fumaça química. Resuspenja as células em 100 microliters ou outra diluição adequada de anticorpo primário rotulado e pipeta para cima e para baixo seis a oito vezes, em seguida, incubar por uma hora em temperatura ambiente.
Em seguida, adicione 750 a 1.000 microliters da solução de tampão de incubação e pipeta para cima e para baixo várias vezes, em seguida, centrifugar as células por cinco minutos a 400 vezes G.Next, resuspend as células em 500 microliters de PBS e quebrar os aglomerados por tubos para cima e para baixo várias vezes. Transfira todo o conteúdo de cada tubo para tubos rotulados com filtros de células. Leve as células para instrumentos de citometria de fluxo apropriados com lasers dos comprimentos de onda corretos.
A calibração óptica foi realizada para os dispositivos. Utilizando a imagem adquirida, foram calculados valores de compensação para LED, o sinal de fundo foi subtraído e a intensidade dos pixels foi deduzida. O coeficiente de variação foi mínimo entre 96 poços.
O software de calibração demonstrou a variação do LED por localização e criou um ajuste de escala cinza para que cada LED seja normalizado com a mesma intensidade. A expressão genética foi induzida em células mais leves projetadas através de microscopia de fluorescência em diferentes durações de pulso de luz no LPA e as células foram imagens para expressão Brightfield e GFP. Usando citometria de fluxo, as células foram induzidas em diferentes valores de comprimento do pulso e mostraram uma resposta de dose da expressão genética quantificada ao nível populacional de mais de quatro vezes a mudança de estados não induzidos.
O feedback negativo alcançou mais de cinco vezes a redução de ruído de expressão genética, como mostrado, comparando vários valores de intensidade de luz para o sistema mais leve versus vívido ou leve ligado. A análise qPCR mostrou que as células mais leves projetadas expressavam níveis de RNA de forma responsiva com indução de mais de dez vezes de estados não induzidos, correspondendo à quantificação da citometria de fluxo. O circuito genético mais leve projetado mostrou quantidades crescentes de luz azul que resultaram no aumento dos níveis de proteína KRAS e níveis de ERK fosforilatos.
Vários ensaios funcionais podem ser realizados, incluindo crescimento, motilidade celular, cicatrização de feridas, proliferação ou ensaios de invasão. Esses métodos poderiam fornecer insights específicos sobre os mecanismos de biologia do câncer, diferenciação tecidual ou resistência a medicamentos.
