Il protocollo optogenetico standardizzato è progettato per i laboratori interessati a utilizzare la luce come stimolo per controllare le proprietà cellulari nei sistemi cellulari di mammiferi ingegnerizzati. Questo protocollo è facile da implementare in laboratori altrimenti non familiari con l'optogenetica e fornisce metodi per un preciso controllo temporale spaziale dei sistemi biologici ingegnerizzati. Questo metodo ha una vasta gamma di applicazioni in specifiche aree di ricerca in cui le informazioni spazio-temporali possono essere importanti, tra cui la biologia del cancro, la biologia dei sistemi e la differenziazione dei tessuti.
Per cominciare, selezionare i componenti genetici da combinare si legano in un singolo circuito genico o plasmide. Ad esempio, siti di integrazione del DNA dei mammiferi, elementi sensibili alla luce o geni funzionali. Dopo aver assemblato ed esaminato tutte le caratteristiche necessarie come codoni di avvio, sequenze regolatorie o tradotte, utilizzare qualsiasi software di ingegneria genetica e clonazione molecolare, annotare e memorizzare le sequenze di DNA per un uso successivo e come riferimento.
Convalidare i primer computazionalmente per la costruzione di plasmidi attraverso le funzionalità del software di clonazione molecolare integrato, ad esempio l'allineamento delle sequenze. Per generare una linea cellulare stabile, trasfettare i circuiti genici di progettazione e le cellule desiderate utilizzando una miscela liposomica del DNA del circuito genico con appropriata ricombinasi. Dopo che le cellule sono confluenti dall'80 al 100%, congelare le cellule in un mix di 45% di vecchi media, 45% di media freschi e 10% di DMSO.
Trasferire le cellule rimanenti in un tubo sterile ed eseguire lo smistamento a singola cellula per isolare le cellule monoclonali in una piastra a 96 pozzetti. Circa due o tre settimane dopo la selezione monoclonale, i pozzetti all'interno della piastra a 96 pozzetti dovrebbero avere focolai. Quando si raggiunge una confluenza dal 50 al 60%, dividere le cellule in una piastra a 12 pozzetti.
Aggiungere il firmware al circuito LPA assemblato utilizzando un programmatore microcontroller. Successivamente, combinare parti stampate in 3D nel circuito assemblato utilizzando la piastra di montaggio, il circuito stampato, il distanziatore LED, l'adattatore per piastra, una piastra a 24 pozzetti, un coperchio della piastra, bulloni di montaggio, dadi alari e componenti impilabili. Per iniziare un esperimento optogenetico, utilizzare il software Iris disponibile sul sito Web Tabor Lab per programmare una scheda SD per l'LPA ed esplorare le condizioni di luce appropriate.
Quindi, immettere i valori di intensità con le repliche tecniche per il contorno sperimentale desiderato. Aggiungere circa 75.000 cellule per pozzetto in una piastra nera a 24 pozzetti in un volume totale di 500 microlitri, quindi posizionare le cellule in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica per consentire loro di stabilirsi da due a sei ore. Dopo aver trasferito le cellule nella cappa di coltura del tessuto alla fine dell'incubazione, rimuovere il coperchio di plastica e aggiungere una striscia di lamina adesiva nella parte superiore della piastra per ridurre al minimo il trasferimento di luce tra i pozzetti in modo che la luce possa entrare solo attraverso il LED situato nella parte inferiore del pozzo.
Posizionare la piastra nelle parti 3D montate dell'LPA, quindi coprire la piastra con il coperchio LPA stampato in 3D che si adatta alle viti del dispositivo su ogni angolo. Collegare il dispositivo alla fonte di alimentazione e premere il pulsante di ripristino sul dispositivo LPA per assicurarsi che vengano applicate le impostazioni aggiornate dell'esperimento LPA e incubare le celle. Dopo l'incubazione, all'interno del cappuccio di coltura del tessuto, rimuovere la striscia di alluminio dalla piastra e lasciare riposare la piastra per uno o due minuti per evitare che si formi condensa sul coperchio di plastica.
Quindi, rimettere il coperchio di plastica originale sulla piastra e visualizzare le cellule con il microscopio a contrasto di fase o fluorescenza appropriato. Dopo 24-72 ore dopo l'induzione, seguita dalla tripsinizzazione, trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzetto di circa 500 microlitri ai tubi etichettati dotati del filtro cellulare. Quindi, utilizzando un appropriato software per strumenti di citometria a flusso, creare un cancello di dispersione anteriore e laterale per catturare le singole cellule delle dimensioni e della granularità appropriate per escludere detriti e grumi cellulari.
Una volta impostato il gate, acquisire circa 10.000 celle con il gate appropriato e regolare il numero di celle in base alla quantità di dati cellulari richiesti e ripetere l'acquisizione di cellule sperimentali in ciascun tubo. Dopo l'induzione e la tripsinizzazione, trasferire l'intero contenuto di ciascun pozzetto di circa 500 microlitri ai tubi etichettati. Centrifugare le cellule per cinque minuti a 400 volte G.Dopo aver scartato il surnatante, spostare i campioni in una cappa chimica.
Risospesso le cellule in 750 a 1.000 microlitri di PFA al 4% diluiti in PBS e pipetta su e giù più volte per rompere i grumi cellulari. Dopo 15 minuti di incubazione, aggiungere da 750 a 1.000 microlitri di PBS e di nuovo pipettare su e giù più volte, quindi pellet giù le celle per cinque minuti a 400 volte G a temperatura ambiente. Dopo aver scartato il surnatante, spostare i campioni in una cappa chimica e risospesciare le celle in 750-1.000 microlitri di metanolo ghiacciato come dimostrato e consentire alle cellule di sedersi per 30 minuti in un congelatore a meno 20 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, aggiungere da 750 a 1.000 microlitri di PBS mentre si esegue il pipettaggio su e giù più volte. Quindi, dopo aver centrifugato le cellule per cinque minuti a 400 volte G, scartare il surnatante e spostare i campioni in una cappa chimica. Risospese le cellule in 100 microlitri o altra diluizione adatta di anticorpi primari marcati e pipette su e giù da sei a otto volte, quindi incubare per un'ora a temperatura ambiente.
Quindi, aggiungere da 750 a 1.000 microlitri del tampone di incubazione e della soluzione di pipetta su e giù più volte, quindi centrifugare le celle per cinque minuti a 400 volte G.Successivamente, risospescere le cellule in 500 microlitri di PBS e rompere i grumi tubando su e giù più volte. Trasferire l'intero contenuto di ciascun tubo in tubi etichettati con filtri per cellule. Portare le cellule ad appositi strumenti di citometria a flusso con laser delle corrette lunghezze d'onda.
La calibrazione ottica è stata eseguita per i dispositivi. Utilizzando l'immagine acquisita, sono stati calcolati i valori di compensazione per il LED, il segnale di sfondo è stato sottratto e l'intensità dei pixel è stata dedotta. Il coefficiente di variazione era minimo tra 96 pozzi.
Il software di calibrazione ha dimostrato la variazione del LED in base alla posizione e ha creato una regolazione della scala di grigi in modo che ogni LED sia normalizzato alla stessa intensità. L'espressione genica è stata indotta in cellule più leggere ingegnerizzate tramite microscopia a fluorescenza a diverse durate di impulsi luminosi sull'LPA e le cellule sono state fotografate per l'espressione di Brightfield e GFP. Utilizzando la citometria a flusso, le cellule sono state indotte a diversi valori di lunghezza dell'impulso e hanno mostrato una risposta alla dose di espressione genica quantificata a livello di popolazione di oltre quattro volte il cambiamento da stati non indotti.
Il feedback negativo ha ottenuto una riduzione del rumore di espressione genica di oltre cinque volte, come mostrato confrontando vari valori di intensità luminosa per il sistema più leggero rispetto a vivido o acceso. L'analisi qPCR ha mostrato che le cellule più leggere ingegnerizzate hanno espresso i livelli di RNA in modo dose-responsivo con un'induzione di oltre dieci volte da stati non indotti, corrispondente alla quantificazione della citometria a flusso. Il circuito genico più leggero ingegnerizzato ha mostrato quantità crescenti di luce blu che hanno portato ad un aumento dei livelli di proteina KRAS e dei livelli di ERK fosforilati.
Possono essere eseguiti diversi saggi funzionali tra cui crescita, motilità cellulare, guarigione delle ferite, proliferazione o analisi di invasione. Questi metodi potrebbero fornire approfondimenti specifici sui meccanismi della biologia del cancro, della differenziazione dei tessuti o della resistenza ai farmaci.
