Este protocolo está diseñado para investigar la diafonía de las células epiteliales y las células inmunes innatas de primera línea, específicamente las células T innatas, que es nuestro interés. Las células primarias de fuentes humanas se utilizan en esta técnica, lo que permite la investigación individual de la diafonía fisiológica relevante para lo que está sucediendo en los seres humanos. Las células T innatas se han implicado en la mejora de la supervivencia de los pacientes infectados por la gripe.
Saber cómo se activan podría ayudar a desarrollar terapia antigripal y antiviral. Este método está diseñado para identificar los factores que pueden activar las células T innatas, lo que puede ayudar a desarrollar medidas preventivas contra la infección por virus respiratorios. En el día cero, infecte las células epiteliales nasales humanas, o HNEC.
Primero, cuente las células agregando 150 microlitros de 1x tripsina EDTA a la cámara apical del inserto de membrana y 350 microlitros de 1x tripsina EDTA a la cámara basal del pozo representativo. Incubar las células a 37 grados centígrados durante 10 minutos o hasta que las células se desprendan de la membrana. Enjuague las células de la membrana mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo y recoja la suspensión en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros.
Agregue 200 microlitros de DMEM para apagar la actividad de tripsina. Luego, cuente las células a través de la tinción azul tripano. Calcule la multiplicidad requerida de infección, o MOI, del virus en función del recuento de células por pozo.
Diluya el stock de virus en consecuencia con RPMI completo en hielo. Para los pocillos restantes para el experimento de infección, agregue un 1x DPBS en las cámaras apicales de los insertos de membrana. Incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos y retirar el 1x DPBS.
Cambie el medio basal en los insertos de membrana a un medio RPMI completo transfiriendo los insertos a una nueva placa con RPMI completo agregado a los pozos. Agregue el inóculo de virus preparado en la cámara apical del inserto de membrana. Incubar a 35 grados centígrados en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% durante una hora y eliminar el inóculo viral de la cámara apical.
Cambie el medio basal del inserto de membrana a un medio RPMI fresco e incube a 35 grados Celsius en una atmósfera de dióxido de carbono al 5% durante 24 a 72 horas. Sembrar el número requerido de células mononucleares de sangre periférica, o PBMC, en medio RPMI completo agregando directamente la suspensión de PBMC en la cámara basal de cada pocillo de HNEC infectados desde el día cero. Incubar a 37 grados centígrados durante 24 a 48 horas.
Para recolectar el sobrenadante apical, agregue 1x DBPS a cada cámara apical e incube a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Luego, recoja el DPBS en tubos de 1.5 mililitros. Alícuota el sobrenadante para el ensayo de placa en un nuevo tubo de 1,5 mililitros e inmediatamente congele tanto la cepa como las alícuotas a menos 80 grados centígrados.
Para recolectar HNEC en forma de ARN, transfiera el inserto de membrana a un pozo limpio. Agregue el tampón de lisis de ARN a la cámara apical e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Recoja el sobrenadante en un tubo centrífugo de 1,5 mililitros y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta la extracción de ARN para su análisis molecular.
Finalmente, recolecte PBMC raspando suavemente la superficie del pozo con la base ancha de una punta de pipeta estéril para desalojar los PBMC activados que pueden estar adheridos a la superficie del pozo. Recoja el medio basal que contiene PBMC en un tubo centrífugo de dos mililitros. Enjuague los pozos dos veces con 300 microlitros de 1x DPBS y recoja el lavado en el mismo tubo de dos mililitros.
Centrifuga el tubo de dos mililitros y recoge el sobrenadante en un tubo fresco de dos mililitros sin perturbar la bolita celular. Guarde el sobrenadante aspirado a menos 80 grados Celsius para el análisis de citoquinas y quimiocinas. Resuspend el pellet celular restante en 200 microlitros de 1x DPBS.
Este protocolo se puede utilizar para estudiar células T innatas después de la infección por influenza sin la necesidad de células epiteliales e inmunes del mismo donante. Aquí se muestra una muestra de la progresión esperada de los HNESPC a medida que crecen en la capa alimentadora 3T3. Estos se utilizaron para la diferenciación en el cultivo de interfaz aire/líquido para obtener HNEC de múltiples capas con células funcionales, ciliadas y caliciformes.
Usando los HNEC, la activación innata de células T se puede investigar mediante citometría de flujo. Estos resultados muestran la detección de células T invariantes asociadas a la mucosa, o células MAIT, V delta uno, células T gamma delta y las células T asesinas naturales o NKT. Estas células aumentaron significativamente en el cocultivo con HNEC infectados con el virus de la influenza.
Esta configuración se puede aplicar a otras cepas del virus de la influenza o poblaciones de células inmunes innatas para observar su respectiva activación en condiciones de cocultivo con células epiteliales infectadas. El cálculo preciso del número de células epiteliales nasales humanas para garantizar que se utiliza la multiplicidad correcta de infección es importante para los niveles óptimos y el momento de activación. La diafonía entre las células epiteliales y las células inmunes innatas está ganando cada vez más atención, y esto se puede aplicar aún más a cualquier otro método que involucre inmunología respiratoria aguda o crónica.
