用于研究呼吸道病毒感染期间先天免疫细胞活化的非接触式共培养模型

该协议旨在研究上皮细胞和一线先天免疫细胞的串扰，特别是先天性T细胞，这是我们感兴趣的。该技术使用来自人类来源的原代细胞，允许对与人类正在发生的事情相关的生理串扰进行个体研究。先天性T细胞与提高流感感染患者的生存率有关。

了解它们如何被激活可以帮助开发抗流感和抗病毒疗法。该方法旨在识别可以激活先天性T细胞的因素，这可能有助于制定针对呼吸道病毒感染的预防措施。在零点，感染人鼻上皮细胞或HNEC。

首先，通过将150微升1x胰蛋白酶EDTA加入膜插入物的顶室和350微升1x胰蛋白酶EDTA到代表性孔的基底室来计数细胞。将细胞在37摄氏度孵育10分钟或直到细胞从膜中分离。通过上下移液将细胞冲洗膜上，并将悬浮液收集在1.5毫升离心管中。

加入200微升DMEM以淬灭胰蛋白酶活性。然后，通过台盼蓝染色计数细胞。根据每孔的细胞计数计算病毒所需的感染多重性或MOI。

在冰上用完全的RPMI相应地稀释病毒储备。对于用于感染实验的其余孔，将一个1x DPBS加入膜插入物的顶端室中。在37摄氏度下孵育10分钟，然后取出1x DPBS。

通过将插入物转移到新板上，将膜插入物转移到孔中加入完整RPMI的新板上，将膜插入物中的基础介质更改为完整的RPMI介质。将制备的病毒接种物加入膜插入物的顶腔中。在35摄氏度的5%二氧化碳气氛中孵育一小时，并从顶点室中取出病毒接种物。

将膜插入物的基础介质更换为新鲜的RPMI培养基，并在35摄氏度的5%二氧化碳气氛中孵育24至72小时。从第零天开始，通过将PBMC悬浮液直接加入受感染HNEC每孔的基底室，在完整的RPMI培养基中接种所需数量的外周血单核细胞或PBMC。在37摄氏度下孵育24至48小时。

为了收集顶端上清液，向每个顶端室加入1x DBPS，并在37摄氏度下孵育10分钟。然后，将DPBS收集在1.5毫升管中。在新的1.5毫升管中等分用于斑块测定的上清液，并立即在零下80摄氏度下冷冻储备液和等分试样。

要收集RNA形式的HNEC，请将膜插入物转移到干净的孔中。将RNA裂解缓冲液加入顶端室，并在室温下孵育五分钟。将上清液收集在1.5毫升离心管中，并将其储存在零下80摄氏度直至RNA提取以进行分子分析。

最后，通过用无菌移液器尖端的宽基部轻轻刮擦孔表面来收集PBMC，以清除可能粘附在孔表面的活化PBMCs。将含有PBMC的基础介质收集在两毫升离心管中。用300微升1x DPBS冲洗孔两次，并将洗涤液收集在同一个两毫升管中。

离心两毫升管并将上清液收集在新鲜的两毫升管中，而不会干扰细胞沉淀。将吸出的上清液储存在零下80摄氏度，用于细胞因子和趋化因子分析。将剩余的细胞沉淀重悬于200微升1x DPBS中。

该方案可用于研究流感感染后的先天性T细胞，而无需来自同一供体的上皮细胞和免疫细胞。此处显示了 HNESPC 在 3T3 馈线层上生长时的预期进展示例。这些用于在空气/液体界面培养物中进行分化，以获得具有功能性，纤毛形和高脚杯细胞的多层HNEC。

使用HNEC，可以使用流式细胞术研究先天性T细胞活化。这些结果显示检测黏膜相关不变性T或MAIT细胞，Vδ 1，γδT细胞和自然杀伤T或NKT细胞。在涉及感染流感病毒的HNEC的共培养物中，这些细胞显着增加。

然后，可以将这种设置应用于其他流感病毒株或先天免疫细胞群，以观察它们在与受感染的上皮细胞共培养条件下各自的激活。准确计算人鼻上皮细胞的数量以确保使用正确的感染多样性对于激活的最佳水平和时间非常重要。上皮细胞和先天免疫细胞之间的串扰越来越受到关注，这可以进一步应用于任何其他涉及急性或慢性呼吸道免疫学的方法。