Dieses Protokoll wurde entwickelt, um das Übersprechen von Epithelzellen und angeborenen Immunzellen der ersten Linie, insbesondere angeborenen T-Zellen, zu untersuchen, was unser Interesse ist. Bei dieser Technik werden Primärzellen aus menschlichen Quellen verwendet, die eine individuelle Untersuchung des physiologischen Übersprechens ermöglichen, das für das Geschehen beim Menschen relevant ist. Angeborene T-Zellen sind an der Verbesserung des Überlebens von Influenza-infizierten Patienten beteiligt.
Zu wissen, wie sie aktiviert werden, könnte bei der Entwicklung einer Anti-Influenza- und antiviralen Therapie helfen. Diese Methode wurde entwickelt, um Faktoren zu identifizieren, die die angeborenen T-Zellen aktivieren können, was bei der Entwicklung von vorbeugenden Maßnahmen gegen Atemwegsvirusinfektionen helfen kann. Infizieren Sie am Tag Null menschliche Nasenepithelzellen oder HNECs.
Zählen Sie zunächst die Zellen, indem Sie 150 Mikroliter 1x Trypsin EDTA in die apikale Kammer des Membraneinsatzes und 350 Mikroliter 1x Trypsin EDTA in die Basalkammer des repräsentativen Brunnens geben. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten oder bis sich die Zellen von der Membran lösen. Spülen Sie die Zellen auf der Membran durch Auf- und Abpipettieren und sammeln Sie die Suspension in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Fügen Sie 200 Mikroliter DMEM hinzu, um die Trypsin-Aktivität zu löschen. Zählen Sie dann die Zellen über die Trypan-Blaufärbung. Berechnen Sie die erforderliche Multiplizität der Infektion oder MOI des Virus basierend auf der Zellzahl pro Well.
Verdünnen Sie den Virenbestand entsprechend mit vollständigem RPMI auf Eis. Für die verbleibenden Vertiefungen für das Infektionsexperiment fügen Sie einen 1x DPBS in die apikalen Kammern der Membraneinsätze hinzu. Bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten inkubieren und die 1x DPBS entfernen.
Ändern Sie das basale Medium in den Membraneinsätzen in vollständiges RPMI-Medium, indem Sie die Einsätze auf eine neue Platte mit vollständigem RPMI zu den Vertiefungen übertragen. Fügen Sie das vorbereitete Virusinokulum in die apikale Kammer des Membraneinsatzes hinzu. Inkubieren Sie bei 35 Grad Celsius in einer 5% Kohlendioxidatmosphäre für eine Stunde und entfernen Sie das virale Inokulum aus der apikalen Kammer.
Wechseln Sie das basale Medium des Membraneinsatzes in frisches RPMI-Medium und inkubieren Sie bei 35 Grad Celsius in einer Kohlendioxidatmosphäre von 5% für 24 bis 72 Stunden. Säen Sie die erforderliche Anzahl peripherer mononukleärer Blutzellen oder PBMCs in vollständigem RPMI-Medium, indem Sie die PBMC-Suspension vom ersten Tag an direkt in die Basalkammer jedes Vertiefungslochs infizierter HNECs geben. Bei 37 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden inkubieren.
Um den apikalen Überstand zu sammeln, fügen Sie 1x DBPS zu jeder apikalen Kammer hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 10 Minuten. Dann sammeln Sie das DPBS in 1,5-Milliliter-Röhrchen. Aliquot den Überstand für den Plaque-Assay in einem neuen 1,5-Milliliter-Röhrchen und frieren Sie sofort sowohl die Brühe als auch die Aliquots bei minus 80 Grad Celsius ein.
Um RNA-förmige HNECs zu sammeln, bringen Sie den Membraneinsatz in einen sauberen Brunnen. Fügen Sie RNA-Lysepuffer in die apikale Kammer hinzu und inkubieren Sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Sammeln Sie den Überstand in einem 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius bis zur RNA-Extraktion für die molekulare Analyse.
Ernten Sie schließlich PBMCs, indem Sie die Oberfläche des Bohrlochs mit der breiten Basis einer sterilen Pipettenspitze vorsichtig abkratzen, um die aktivierten PBMCs zu entfernen, die an der Bohrlochoberfläche haften können. Sammeln Sie das PBMCs enthaltende Basalmedium in einem Zwei-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit 300 Mikrolitern 1x DPBS und sammeln Sie die Wäsche im selben Zwei-Milliliter-Rohr.
Zentrifugieren Sie das Zwei-Milliliter-Röhrchen und sammeln Sie den Überstand in einem frischen Zwei-Milliliter-Röhrchen, ohne das Zellpellet zu stören. Lagern Sie den angesaugten Überstand bei minus 80 Grad Celsius für die Zytokin- und Chemokinanalyse. Resuspendiert das verbleibende Zellpellet in 200 Mikrolitern von 1x DPBS.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, um angeborene T-Zellen nach einer Influenza-Infektion zu untersuchen, ohne dass Epithel- und Immunzellen desselben Spenders benötigt werden. Eine Stichprobe der erwarteten Progression der HNESPCs, wenn sie auf der 3T3-Feederschicht wachsen, ist hier gezeigt. Diese wurden zur Differenzierung in der Luft/Flüssigkeits-Grenzflächenkultur verwendet, um mehrschichtige HNECs mit funktionellen, Flimmer- und Becherzellen zu erhalten.
Mit Hilfe der HNECs kann die angeborene T-Zell-Aktivierung mittels Durchflusszytometrie untersucht werden. Diese Ergebnisse zeigen den Nachweis von schleimhautassoziierten invarianten T- oder MAIT-Zellen, V-Delta-Eins-, Gamma-Delta-T-Zellen und dem natürlichen Killer T oder NKT-Zellen. Diese Zellen waren in der Co-Kultur mit HNECs, die mit dem Influenzavirus infiziert waren, signifikant erhöht.
Dieses Setup kann dann auf andere Influenzavirusstämme oder angeborene Immunzellpopulationen angewendet werden, um ihre jeweilige Aktivierung unter Co-Kulturbedingungen mit infizierten Epithelzellen zu beobachten. Eine genaue Berechnung der Anzahl der menschlichen Nasenepithelzellen, um sicherzustellen, dass die richtige Infektionsvielfalt verwendet wird, ist wichtig für ein optimales Niveau und den Zeitpunkt der Aktivierung. Das Übersprechen zwischen Epithelzellen und angeborenen Immunzellen gewinnt zunehmend an Aufmerksamkeit, und dies kann auf alle anderen Methoden der akuten oder chronischen Atemwegsimmunologie angewendet werden.
