Bu protokol, epitel hücrelerinin ve birinci basamak doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin, özellikle de doğuştan gelen T hücrelerinin çapraz konuşmasını araştırmak için tasarlanmıştır. İnsan kaynaklarından birincil hücreler bu teknikte kullanılır ve insanlarda olanlarla ilgili fizyolojik çapraz konuşmanın bireysel olarak araştırılmasına izin verir. Doğuştan gelen T hücreleri, influenza ile enfekte hastaların sağkalımını iyileştirmede rol oynamıştır.
Nasıl aktive olduklarını bilmek, anti-influenza ve antiviral tedavinin geliştirilmesinde yardımcı olabilir. Bu yöntem, doğuştan gelen T hücrelerini aktive edebilen faktörleri tanımlamak için tasarlanmıştır ve bu da solunum virüsü enfeksiyonuna karşı önleyici tedbirlerin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Sıfır gününde, insan burun epitel hücrelerini veya HNEC'leri enfekte edin.
İlk olarak, membran ekinin apikal odasına 150 mikrolitre 1x tripsin EDTA ve temsilci kuyucuğun bazal odasına 350 mikrolitre 1x tripsin EDTA ekleyerek hücreleri sayın. Hücreleri 10 dakika boyunca veya hücreler zardan ayrılana kadar 37 santigrat derecede inkübe edin. Membran üzerindeki hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın ve süspansiyonu 1,5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın.
Tripsin aktivitesini söndürmek için 200 mikrolitre DMEM ekleyin. Ardından, tripan mavisi boyama yoluyla hücreleri sayın. Kuyucuk başına düşen hücre sayısına bağlı olarak virüsün gerekli enfeksiyon çokluğunu veya MOI'sini hesaplayın.
Virüs stoğunu buz üzerinde tam RPMI ile buna göre seyreltin. Enfeksiyon deneyi için kalan kuyucuklar için, membran eklerinin apikal odalarına bir adet 1x DPBS ekleyin. 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin ve 1x DPBS'yi çıkarın.
Membran uçlarındaki bazal ortamı, uçları kuyucuklara tam RPMI eklenmiş yeni bir plakaya aktararak RPMI ortamını tamamlamak için değiştirin. Hazırlanan virüs inokulunumu, membran ekinin apikal odasına ekleyin. Bir saat boyunca% 5'lik bir karbondioksit atmosferinde 35 santigrat derecede inkübe edin ve viral inokulumu apikal odadan çıkarın.
Membran ekinin bazal ortamını taze RPMI ortamına değiştirin ve 24 ila 72 saat boyunca% 5'lik bir karbondioksit atmosferinde 35 santigrat derecede inkübe edin. PBMC süspansiyonunu doğrudan enfekte olmuş HNEC'lerin her bir kuyucuğunun bazal odasına sıfır gününden itibaren ekleyerek gerekli sayıda periferik kan mononükleer hücresini veya PBMC'yi tam RPMI ortamında tohumlayın. 24 ila 48 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Apikal süpernatanı toplamak için, her apikal odaya 1x DBPS ekleyin ve 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, DPBS'yi 1,5 mililitrelik tüplerde toplayın. Plak tahlili için süpernatant Aliquot yeni bir 1.5 mililitrelik tüp içinde ve hemen hem stoğu hem de alikotları eksi 80 santigrat derecede dondurun.
RNA formundaki HNEC'leri toplamak için, membran ekini temiz bir kuyucuğa aktarın. Apikal odaya RNA lizis tamponu ekleyin ve beş dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Süpernatantı 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın ve moleküler analiz için RNA ekstraksiyonuna kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Son olarak, kuyu yüzeyine yapışmış olabilecek aktif PBMC'leri yerinden çıkarmak için kuyunun yüzeyini steril bir pipet ucunun geniş tabanıyla nazikçe kazıyarak PBMC'leri hasat edin. PBMC'leri içeren bazal ortamı iki mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Kuyucukları 300 mikrolitre 1x DPBS ile iki kez yıkayın ve yıkamayı aynı iki mililitrelik tüpte toplayın.
İki mililitrelik tüpü santrifüj edin ve süpernatantı hücre peletini rahatsız etmeden taze iki mililitrelik bir tüpte toplayın. Aspire edilen süpernatantı sitokin ve kemokin analizi için eksi 80 santigrat derecede saklayın. Kalan hücre peletini 200 mikrolitre 1x DPBS içinde yeniden askıya alın.
Bu protokol, aynı donörden epitel ve bağışıklık hücrelerine ihtiyaç duymadan influenza enfeksiyonunu takiben doğuştan gelen T hücrelerini incelemek için kullanılabilir. HNESPC'lerin 3T3 besleyici tabakasında büyüdükçe beklenen ilerlemesinin bir örneği burada gösterilmiştir. Bunlar, işlevsel, siliyer ve kadeh hücrelerine sahip çok katmanlı HNEC'ler elde etmek için hava / sıvı arayüz kültüründe farklılaşma için kullanıldı.
HNEC'ler kullanılarak, doğuştan gelen T hücresi aktivasyonu, akış sitometrisi kullanılarak araştırılabilir. Bu sonuçlar, mukozal ilişkili değişmez T veya MAIT hücrelerinin, V delta bir, gama delta T hücrelerinin ve doğal katil T veya NKT hücrelerinin tespitini göstermektedir. Bu hücreler, influenza virüsü ile enfekte olmuş HNEC'leri içeren ko-kültürde anlamlı olarak artmıştır.
Bu kurulum daha sonra enfekte epitel hücreleri ile ko-kültür koşulları altında ilgili aktivasyonlarını gözlemlemek için diğer influenza virüsü suşlarına veya doğuştan gelen bağışıklık hücresi popülasyonlarına uygulanabilir. Doğru enfeksiyon çokluğunun kullanıldığından emin olmak için insan burun epitel hücrelerinin sayısının doğru hesaplanması, optimal aktivasyon seviyeleri ve zamanlaması için önemlidir. Epitel hücreleri ve doğuştan gelen bağışıklık hücreleri arasındaki çapraz konuşma giderek daha fazla dikkat çekmektedir ve bu, akut veya kronik solunum immünolojisini içeren diğer yöntemlere daha fazla uygulanabilir.
