تم تصميم هذا البروتوكول للتحقيق في الحديث المتبادل للخلايا الظهارية والخلايا المناعية الفطرية من الخط الأول ، وتحديدا الخلايا التائية الفطرية ، وهو ما يهمنا. يتم استخدام الخلايا الأولية من المصادر البشرية في هذه التقنية ، مما يسمح بالتحقيق الفردي في الحديث المتبادل الفسيولوجي ذي الصلة بما يحدث في البشر. تورطت الخلايا التائية الفطرية في تحسين بقاء المرضى المصابين بالأنفلونزا على قيد الحياة.
معرفة كيفية تنشيطها يمكن أن تساعد في تطوير العلاج المضاد للإنفلونزا والفيروسات. تم تصميم هذه الطريقة لتحديد العوامل التي يمكن أن تنشط الخلايا التائية الفطرية ، والتي قد تساعد في تطوير تدابير وقائية ضد عدوى فيروس الجهاز التنفسي. في اليوم صفر ، تصيب الخلايا الظهارية الأنفية البشرية ، أو HNECs.
أولا ، عد الخلايا عن طريق إضافة 150 ميكرولتر من 1x trypsin EDTA إلى الغرفة القمية لإدراج الغشاء و 350 ميكرولتر من 1x trypsin EDTA إلى الغرفة القاعدية للبئر التمثيلي. احتضن الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أو حتى تنفصل الخلايا عن الغشاء. اغسل الخلايا على الغشاء عن طريق السحب لأعلى ولأسفل وجمع التعليق في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر.
أضف 200 ميكرولتر من DMEM لإخماد نشاط التربسين. ثم عد الخلايا عن طريق تلطيخ التربان الأزرق. احسب التعدد المطلوب للعدوى ، أو MOI ، للفيروس بناء على عدد الخلايا لكل بئر.
تمييع مخزون الفيروس وفقا لذلك مع RPMI الكامل على الجليد. بالنسبة للآبار المتبقية لتجربة العدوى ، أضف 1x DPBS إلى الغرف القمية لإدراج الغشاء. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وإزالة 1x DPBS.
قم بتغيير الوسط القاعدي في إدخالات الغشاء لإكمال وسط RPMI عن طريق نقل الإدخالات إلى لوحة جديدة مع إضافة RPMI كاملة إلى الآبار. أضف لقاح الفيروس المحضر إلى الغرفة القمية لإدراج الغشاء. احتضان في 35 درجة مئوية في جو 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة وإزالة التلقيح الفيروسي من الغرفة القمي.
قم بتغيير الوسط القاعدي لإدراج الغشاء إلى وسط RPMI طازج واحتضنه عند 35 درجة مئوية في جو من ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪ لمدة 24 إلى 72 ساعة. زرع العدد المطلوب من خلايا الدم الطرفية أحادية النواة ، أو PBMCs ، في وسط RPMI كامل عن طريق إضافة تعليق PBMC مباشرة إلى الغرفة القاعدية لكل بئر من HNECs المصابة من اليوم صفر. تحضن عند 37 درجة مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة.
لجمع السوبرناتانت القمي ، أضف 1x DBPS إلى كل غرفة قمية واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم ، جمع DPBS في أنابيب 1.5 ملليلتر. Aliquot supernatant لفحص البلاك في أنبوب جديد 1.5 ملليلتر وتجميد كل من المخزون و aliquots على الفور عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
لجمع HNECs على شكل الحمض النووي الريبي ، انقل إدراج الغشاء إلى بئر نظيف. أضف المخزن المؤقت لتحلل الحمض النووي الريبي إلى الغرفة القمية واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. جمع supernatant في أنبوب جهاز طرد مركزي 1.5 ملليلتر وتخزينه في ناقص 80 درجة مئوية حتى استخراج الحمض النووي الريبي للتحليل الجزيئي.
وأخيرا، قم بحصاد PBMCs عن طريق كشط سطح البئر بلطف باستخدام القاعدة العريضة لطرف ماصة معقم لإزاحة PBMCs المنشطة التي قد تكون ملتصقة بسطح البئر. اجمع الوسط القاعدي الذي يحتوي على PBMCs في أنبوب طرد مركزي سعة مليلترين. اغسل الآبار مرتين ب 300 ميكرولتر من 1x DPBS وجمع الغسيل في نفس الأنبوب سعة ملليلترين.
الطرد المركزي للأنبوب سعة مليلترين وجمع السوبرناتانت في أنبوب جديد سعة مليلترين دون إزعاج بيليه الخلية. قم بتخزين السوبرناتانت المستنشق عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لتحليل السيتوكين والكيموكين. أعد تعليق بيليه الخلية المتبقية في 200 ميكرولتر من 1x DPBS.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لدراسة الخلايا التائية الفطرية بعد الإصابة بالأنفلونزا دون الحاجة إلى خلايا ظهارية ومناعية من نفس المتبرع. تظهر عينة من التقدم المتوقع ل HNESPCs أثناء نموها على طبقة التغذية 3T3 هنا. تم استخدامها للتمايز في ثقافة واجهة الهواء / السائل للحصول على HNECs متعددة الطبقات مع خلايا وظيفية وهدبية وكأسية.
باستخدام HNECs ، يمكن التحقيق في تنشيط الخلايا التائية الفطرية باستخدام قياس التدفق الخلوي. تظهر هذه النتائج الكشف عن الخلايا الثابتة المرتبطة بالغشاء المخاطي T ، أو خلايا MAIT ، وخلايا V delta one ، وخلايا gamma delta T ، والخلايا القاتلة الطبيعية T ، أو NKT. وقد زادت هذه الخلايا زيادة كبيرة في الزراعة المشتركة التي تشمل HNECs المصابة بفيروس الأنفلونزا.
يمكن بعد ذلك تطبيق هذا الإعداد على سلالات فيروس الأنفلونزا الأخرى ، أو مجموعات الخلايا المناعية الفطرية لمراقبة تنشيطها في ظل ظروف الزراعة المشتركة مع الخلايا الظهارية المصابة. يعد الحساب الدقيق لعدد الخلايا الظهارية الأنفية البشرية لضمان استخدام التكاثر الصحيح للعدوى أمرا مهما للمستويات المثلى وتوقيت التنشيط. يكتسب الحديث المتبادل بين الخلايا الظهارية والخلايا المناعية الفطرية اهتماما متزايدا ، ويمكن تطبيق ذلك بشكل أكبر على أي طرق أخرى تنطوي على علم المناعة التنفسي الحاد أو المزمن.
