Этот протокол предназначен для исследования перекрестных помех эпителиальных клеток и врожденных иммунных клеток первой линии, в частности врожденных Т-клеток, что является нашим интересом. Первичные клетки из человеческих источников используются в этой технике, что позволяет индивидуально исследовать физиологические перекрестные помехи, имеющие отношение к тому, что происходит у людей. Врожденные Т-клетки были вовлечены в улучшение выживаемости пациентов, инфицированных гриппом.
Знание того, как они активируются, может помочь в разработке противогриппозной и противовирусной терапии. Этот метод предназначен для выявления факторов, которые могут активировать врожденные Т-клетки, что может помочь в разработке профилактических мер против респираторной вирусной инфекции. В нулевой день заражают эпителиальные клетки носа человека, или ГНЕК.
Во-первых, подсчитывают клетки путем добавления 150 микролитров 1x трипсина ЭДТА в апикальную камеру мембранной вставки и 350 микролитров 1x трипсина ЭДТА в базальную камеру репрезентативного колодца. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут или до тех пор, пока клетки не отсоединятся от мембраны. Промывайте клетки на мембране путем пипетки вверх и вниз и соберите суспензию в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку.
Добавьте 200 микролитров DMEM для подавления активности трипсина. Затем подсчитайте клетки с помощью окрашивания в синий цвет трипана. Рассчитайте требуемую кратность инфекции, или MOI, вируса на основе количества клеток на скважину.
Разбавьте вирусный запас соответствующим образом с полным RPMI на льду. Для оставшихся колодцев для эксперимента с инфекцией добавьте один 1x DPBS в апикальные камеры мембранных вставок. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10 минут и удалить 1x DPBS.
Измените базальную среду в мембранных вставках на полную среду RPMI, перенеся вставки на новую пластину с полным RPMI, добавленным в колодцы. Добавьте приготовленный вирусный инокулятив в апикальную камеру мембранной вставки. Инкубируйте при 35 градусах Цельсия в атмосфере с содержанием углекислого газа 5% в течение одного часа и удалите вирусный инокулят из апикальной камеры.
Измените базальную среду мембранной вставки на свежую среду RPMI и инкубируйте при 35 градусах Цельсия в атмосфере 5% углекислого газа в течение 24-72 часов. Засейте необходимое количество мононуклеарных клеток периферической крови, или PBMCs, в полную среду RPMI путем непосредственного добавления суспензии PBMC в базальную камеру каждого колодца инфицированных ГНЭК с нулевого дня. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24-48 часов.
Чтобы собрать верхушечный супернатант, добавьте 1x DBPS в каждую апикальную камеру и высиживайте при 37 градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем соберите DPBS в 1,5-миллилитровые трубки. Аликвот супернатант для анализа бляшек в новой 1,5-миллилитровой трубке и сразу же замораживает как запас, так и аликвоты при минус 80 градусах Цельсия.
Чтобы собрать РНК-образные ГНЕК, перенесите мембранную вставку в чистый колодец. Добавьте буфер лизиса РНК в апикальную камеру и инкубируйте при комнатной температуре в течение пяти минут. Соберите супернатант в 1,5-миллилитровую центрифужную трубку и храните его при минус 80 градусах Цельсия до экстракции РНК для молекулярного анализа.
Наконец, собирайте НБМК, аккуратно соскребая поверхность скважины широким основанием стерильного наконечника пипетки, чтобы вытеснить активированные НБМК, которые могут прилипать к поверхности скважины. Соберите базальную среду, содержащую НБМК, в двухмиллилитровую центрифужную трубку. Промывайте скважины дважды 300 микролитрами 1x DPBS и соберите промывку в ту же двухмиллилитровую трубку.
Центрифугируйте двухмиллилитровую трубку и соберите супернатант в свежую двухмиллилитровую трубку, не нарушая гранулу ячейки. Храните аспирированный супернатант при температуре минус 80 градусов Цельсия для анализа цитокинов и хемокинов. Повторно суспендируйте оставшуюся ячейку гранулы в 200 микролитров 1x DPBS.
Этот протокол может быть использован для изучения врожденных Т-клеток после инфекции гриппа без необходимости использования эпителиальных и иммунных клеток от одного и того же донора. Здесь показан пример ожидаемого прогрессирования ГЭСПК по мере их роста на фидерном слое 3T3. Они использовались для дифференцировки в культуре раздела воздух/жидкость для получения многослойных ГНЭК с функциональными, реснитчатыми и бокаловидными клетками.
Используя ГНЕК, врожденную активацию Т-клеток можно исследовать с помощью проточной цитометрии. Эти результаты показывают обнаружение связанных со слизистой оболочкой инвариантных Т-клеток, или MAIT-клеток, V-дельта-один, гамма-дельта-Т-клеток и естественных Т-киллеров, или NKT-клеток. Эти клетки были значительно увеличены в совместной культуре с участием ГНЕК, инфицированных вирусом гриппа.
Затем эта установка может быть применена к другим штаммам вируса гриппа или врожденным популяциям иммунных клеток для наблюдения за их соответствующей активацией в условиях кокультуры с инфицированными эпителиальными клетками. Точный расчет количества эпителиальных клеток носа человека для обеспечения использования правильной множественности инфекции важен для оптимальных уровней и сроков активации. Перекрестные помехи между эпителиальными клетками и врожденными иммунными клетками все чаще привлекают внимание, и это может быть применено в дальнейшем к любым другим методам, связанным с острой или хронической респираторной иммунологией.
