Este flujo de trabajo de disección y análisis de montaje completo proporciona un enfoque novedoso para analizar la morfología completa de los cenadores de nervios del gusto individuales, la transducción de números de tipo celular y las relaciones físicas entre las células. La recolección de todo el epitelio lingual nos permite medir el número absoluto de células y el volumen de inervación dentro de toda la papila gustativa. Este enfoque es más preciso que las estimaciones de la estructura celular basadas en el muestreo de secciones, lo que reduce la variabilidad técnica.
Este es también el primer método que proporciona un análisis detallado de las células de las papilas gustativas en relación con su inervación. Este método puede mejorar las investigaciones sobre los circuitos potenciales dentro de la papila gustativa, así como los procesos de enfermedad y las quimioterapias que interrumpen la función normal del gusto. En la mayoría de estos casos, no está claro qué estructura o relación se interrumpe, por lo que mantener todos esos factores intactos permite todos los análisis dentro de una sola preparación.
El error más común es tratar de evitar dañar el epitelio al no diseccionar lo suficientemente cerca de la parte inferior del epitelio. Es imperativo eliminar la mayor cantidad posible de tejido subyacente antes de congelar el tejido en el molde de tejido. También es importante asegurarse de que el epitelio se coloque plano en el fondo del molde de tejido.
Comience descongelando y enjuagando la lengua en un tampón de fosfato molar 0.1. Luego coloque 1/2 de la lengua anterior que contiene las papilas fungiformes en un portaobjetos de vidrio bajo un microscopio de disección. Use pinzas romas y tijeras de disección para extirpar el músculo y mantener el tejido abierto a medida que el epitelio lingual se curva, asegurando una orientación plana del tejido al mantener las cuchillas de las tijeras de disección gruesas paralelas al epitelio.
Deseche el epitelio ventral no queratinizado de la lengua, ya que no contiene papilas gustativas. Luego use tijeras de disección finas para una disección más cercana a la parte inferior del epitelio queratinizado. Use fórceps contundentes para colocar un pedazo de epitelio en un molde de tejido y asegúrese de que quede plano.
Luego agregue una gota de compuesto de temperatura de corte óptima, o OCT, al tejido. Coloque el molde de tejido sobre una base de metal previamente enfriada debajo del endoscopio de disección, luego continúe golpeando el tejido ligeramente con las pinzas hasta que la OCT se haya congelado, asegurando que el tejido se congele lo más plano posible. Una vez que el OCT se haya congelado, agregue rápidamente OCT adicional y coloque el molde en un vaso de precipitados de 2-metilbutano enfriado hasta que se congele.
Monte el molde OCT en el criostato y córtelo en secciones de 20 micras. Recoja cada sección y visualícela bajo el microscopio de luz para evaluar su proximidad a la base del epitelio. Después de afeitar el tejido de la parte inferior del epitelio, descongele el epitelio y enjuáguelo dos veces en PB molar 0.1 en una coctelera.
Corte el paladar duro anterior a la unión del paladar blando y duro, luego separe el paladar blando del tejido subyacente, asegurándose de que se corten los fragmentos de hueso restantes y eliminando el músculo y el tejido conectivo adicionales. Sostenga el paladar con pinzas romas y retire las glándulas restantes y pierda el tejido conectivo raspándolas suavemente con una cuchilla de afeitar. Las papilas gustativas enteras y toda la inervación de las papilas gustativas en ratones Phox2b-Cre TdTomato se etiquetaron tiñendo el epitelio lingual con anticuerpos para DsRed y queratina ocho.
Se midió el volumen de las papilas gustativas y no reveló correlaciones entre los volúmenes de las papilas gustativas y los volúmenes de inervación en las regiones de medición fungiformes o circunvaladas. La administración de una dosis baja de tamoxifeno en ratones TrkB CreER TdTomato causa la recombinación de genes y el etiquetado de un pequeño número de neuronas. Aquí se muestra una papila gustativa de montaje entero teñida con marcadores celulares transductores del gusto anhidrasa carbónica cuatro y fosfolipasa C beta dos.
Esta papila gustativa tiene dos cenadores terminales etiquetados, que se muestran con la papila gustativa eliminada después de reconstruir las fibras. El uso de software de imágenes basado en píxeles celulares para determinar la proximidad más cercana entre las fibras nerviosas y las células transductoras de sabor reveló que de 19 células transductoras de sabor, el cenador terminal azul estaba dentro de los 200 nanómetros de la anhidrasa carbónica azul claro cuatro más células. El cenador terminal asociado con el trazado verde se muestra en magenta y está a menos de 200 nanómetros de las cuatro células más de anhidrasa carbónica azul claro y oscuro.
La tinción de queratina ocho de montura entera y 5-etinil-2'desoxiuridina o EdU de papilas gustativas fungiformes reveló que las células marcadas con EdU estaban presentes tanto dentro como fuera de las papilas gustativas. Los núcleos magenta y púrpura se observan fuera del borde de queratina ocho más de la papila gustativa. Las células amarillas, verde azulado y azulado estaban dentro de la papila gustativa.
Al intentar este protocolo, los pasos de disección y congelación de tejidos son fundamentales. Estos métodos de disección de tejidos pueden ser seguidos por la tinción de una variedad de células y estructuras para analizar las relaciones tanto dentro de la papila gustativa como fuera de la papila gustativa, pero dentro de la papila. Este es el primer análisis de cenadores de sabor completos dentro de la papila gustativa, así como sus relaciones con las células transductoras del gusto.
Preservar y teñir varios de estos elementos en una sola preparación amplía las posibilidades de análisis y refina las mediciones que son posibles.
