Este protocolo permite observar las funciones de las células gustales en un microambiente natural con conexiones neuronales y circulación sanguínea que permanecen intactas. Usando esta técnica, la comunicación de célula a célula se puede investigar in vivo. Para comenzar, llene los reservorios del sistema de perfusión de flujo presurizado con saliva artificial y saborizantes.
Conecte la línea de aire comprimido a la entrada del regulador y ajuste la presión de aire en el sistema de suministro fluídico a 30 a 50 libras por pulgada cuadrada. Ajuste la presión de salida del regulador a 0.4 libras por pulgada cuadrada y verifique si el líquido comienza a fluir desde el tubo. Conecte el colector de los depósitos al puerto de entrada de la micro lengua, luego conecte el puerto de salida de la micro lengua a una bomba de jeringa y retire el líquido a aproximadamente 300 microlitros por minuto para establecer una condición de estado estacionario.
Confirme que el volumen de la gota que cuelga debajo de la micro lengua permanezca constante y ajuste la presión de aire y el caudal para obtener la altura de muestra deseada. Una vez que se haya configurado el sistema microfluídico, desconecte la línea de aire comprimido y apague la bomba de la jeringa hasta que el ratón se haya preparado para la obtención de imágenes in vivo. Después de administrar anestesia al ratón, inyecte TRITC-dextrano por vía intravenosa a través de una ruta retroorbital para observar la circulación sanguínea durante las imágenes.
Con el ratón colocado en posición supina, rocíe etanol al 70% en su cabeza. Use pinzas para levantar la piel de la cabeza ligeramente, luego use tijeras para cortar aproximadamente siete milímetros cuadrados de piel. Después de limpiar el cabello alrededor del cuero cabelludo, retire el periostio de debajo de la piel y aplique un adhesivo instantáneo en el cráneo.
A continuación, conecte el fijador de cabeza personalizado. Una vez que el adhesivo instantáneo se endurece, aplique pegamento dental alrededor del fijador de cabeza y solidifíquelo mediante iluminación con una luz azul. Usando adhesivo instantáneo para pegar el labio inferior del ratón a la unidad inferior de la micro lengua, luego coloque el ratón en la placa de preparación del ratón y asegure la unidad inferior en la micro lengüeta a los postes de sución alineando los orificios en el borde de la micro lengua con los postes.
Apriete el fijador de cabeza del ratón en el soporte del fijador de cabeza en la placa y ajuste la distancia entre el cabezal del ratón y el dispositivo. Luego, usando el soporte fijador de cabeza, gire la cabeza del mouse suavemente en aproximadamente 45 grados. Después de asegurar el mouse a la tabla, use pinzas de plástico para dibujar su lengua suavemente.
Luego, usando adhesivo instantáneo, conecte el lado ventral de la lengua al lado superior de la unidad inferior de la micro lengua. Para mantener la lengua húmeda, limpie la superficie con un hisopo de algodón húmedo, luego coloque un trozo de tejido empapado en saliva artificial en la superficie expuesta de la lengua. Coloque las arandelas curvas en los postes, sosteniendo la parte inferior de la micro lengua, luego mueva la preparación del mouse a la etapa de microscopio.
Coloque la lengüeta expuesta del ratón debajo del centro aproximado del área objetivo del microscopio, asegurándose de no desviarse del rango dinámico del escenario, luego apriete los tornillos para unir firmemente la placa del mouse en el escenario. Coloque una almohadilla térmica debajo del mouse para mantener su temperatura corporal entre 36.5 y 37.5 grados centígrados. Para evitar que el líquido entre en la tráquea del ratón, coloque un trozo delgado de papel retorcido dentro de la boca del ratón, luego retire el tejido húmedo colocado en la superficie de la lengua y coloque la micro lengua preparada en la lengua del ratón, de modo que la superficie de la lengua sea visible a través de la ventana de imágenes.
Asegure la micro lengüeta atornillando suavemente ambos extremos con una presión de compresión mínima. Para comenzar a adquirir imágenes, abra el software del microscopio y luego encienda el láser de dos fotones de 920 nanómetros. Monte el objetivo de inmersión en agua en el microscopio, luego baje el objetivo en la ventana de imágenes de la micro lengua y sumerja el objetivo.
En el modo de cámara, ilumine la superficie de la lengua encendiendo la luz azul de una lámpara de mercurio. Para encontrar el plano focal aproximado, ajuste el eje Z y busque una señal de autofluorescencia de las papilas filiformes. Luego, usando la perilla de ajuste X e Y, ubique una papila gustativa.
Cambie al modo multi fotones y, a continuación, configure la longitud de onda de excitación, el conjunto de filtros de emisión, el modo de escaneo y el tamaño del fotograma para la adquisición de imágenes. Con la papila gustativa en el centro de la ventana de imágenes, ubique los vasos sanguíneos que rodean la papila gustativa a aproximadamente dos tercios de la altura de la papila gustativa y visualice la circulación sanguínea. Si el flujo sanguíneo está obstruido, afloje ligeramente los tornillos de fijación para reanudar el flujo sanguíneo.
Ajuste el eje Z para encontrar el plano Z de una papila gustativa que contenga un número adecuado de células gustativas, luego proceda con imágenes de calcio de dos a seis Hertz durante 80 segundos. Después de que comiencen las imágenes, encienda el depósito del sistema fluídico para proporcionar una solución de sabor durante 20 segundos. Después de 20 segundos de estimulación del gusto, cambie el reservorio de nuevo a saliva artificial.
Durante la obtención de imágenes, espere entre tres y cuatro minutos entre sesiones proporcionando saliva artificial constantemente para mantener la lengua húmeda y lavar el sabor restante de la sesión anterior. La superficie de la lengua del ratón Pirt-GCaMP6f-tdTomato está cubierta con papilas filiformes autofluorescentes y papilas gustativas escasamente extendidas. Las papilas filiformes en amarillo se capturan utilizando un fotodetector a 500 a 550 nanómetros y se pueden observar desde la superficie misma de la lengua hasta aproximadamente 25 micrómetros de profundidad.
Las señales GCaMP en verde detectadas por el filtro de 500 a 550 nanómetros y las señales tdTomato en rojo, detectadas por el filtro de 607 a 670 nanómetros, representan las células gustales. La señal tdTomato se obtiene para el análisis métrico de la relación. Los vasos sanguíneos que rodean la papilas gustativas se adquieren utilizando el filtro de 500 a 550 nanómetros establecido en el tejido conectivo de colágeno, que estructuralmente soporta la papilas gustativas, se adquiere utilizando el conjunto de filtros de 447 a 460 nanómetros.
En este ejemplo representativo de detección de sabor in vivo utilizando imágenes de calcio, cada célula gusta gusta gustar está demarcada por líneas discontinuas. En este ensayo, la célula 2 respondió a los sabores dulces y umami. Y la celda 3 respondió a los sabores bajos y altos en sal.
Ninguna de las células de esta papila gustativa respondió a los sabores agrios. Dado que el propósito de este experimento es observar la función celular de los sabores en el entorno natural, es importante administrar los fluorescentes en los vasos sanguíneos en la etapa de preparación y confirmar su circulación durante el experimento.
