We gratefully acknowledge Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands) for the kind gift of TOPflash cells.
This project was supported in part by NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Digestive Health Center); NIH UL1RR026314 (CTSA).

Declaración de Ética: NOTA: Todos los experimentos usando tejidos humanos descritos en el presente documento fue aprobado por un IRB en CCHMC (IRB # 2012-2858; # 2014 hasta 0427). El consentimiento informado para la recogida de tejidos, almacenamiento y uso de las muestras se obtuvo de los donantes en CCHMC. 1. Preparación para la Cultura NOTA: Todos los reactivos se enumeran en la Tabla 1. <ol><li> Preparar solución madre de EDTA como sigue: preparar 0,5 M de ácido etilendiaminotetraacético, pH 8 (EDTA) en ultrapura H 2 O, filtro esterilizado con filtro de 0,22 micras. Opcionalmente, almacenar la solución de EDTA acciones en RT indefinidamente. </li><li> Preparar tampón quelante como sigue: mezclar 2% de sorbitol, 1% de sacarosa, 1% de albúmina sérica bovina fracción V (BSA) y 1x gentamicina / anfotericina solución en fosfato de Dulbecco solución salina tamponada sin Ca2 + y Mg2 + (DPBS), filtro esterilizado con 0,22 micras filtro. Prepare el buf quelantefresco fer. </li><li> Prepare medio Wnt-3A-condicionado como sigue: medio acondicionado-Wnt-3A está hecha en casa usando la línea celular L Wnt-3A de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ATCC, CRL-2647). Suplemento el medio con glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, 100 U / ml de penicilina, 100 g / ml de estreptomicina, 1 suplemento N2, 1 suplemento B27, 1% de BSA y esterilizar por filtración con filtro de 0,22-micras. NOTA: Prueba de cada lote para la actividad Wnt utilizando un ensayo TOPflash. Utilice una línea celular HEK293 estable TOPflash (laboratorio de Hans Clevers) con un kit de ensayo de luciferasa de Renilla de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Normalizar el ensayo TOPflash con 100 ng / ml Wnt-3A recombinante humano. Confirmar al menos una actividad de 10 veces el cambio de los medios condicionados comparación con el control. Divida medio condicionado-Wnt-3A fresco en alícuotas de 10 ml en 15 ml tubos cónicos y congelación a -20 ° C durante un máximo de 6 meses. Tienda descongelado alícuotas hasta 5 días a 4 ° C sin pérdida de actividad. </li><li> Prepare medio minigut humano como sigue: Suplemento Advanced medio DMEM / F12 con glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, 100 U / ml de penicilina, / ml de estreptomicina, 1 suplemento de 100 g N2, 1 suplemento B27, 1% de BSA y esterilizar por filtración con 0,22 filtro de micras. NOTA: Divida medio minigut humana fresca en alícuotas de 10 ml en 15 ml tubos cónicos y congelación a -20 ° C hasta por 3 meses. Tienda descongelado alícuotas hasta 5 días a 4 ° C sin pérdida de actividad. </li><li> Preparar medio completo minigut humano de la siguiente manera: Prepare fresco antes cripta cultura o cambio de medio a medio minigut humana (véase 1.4), complementado con un 50% de medio Wnt-3A acondicionado (véase 1.3), 1 mg / ml R-espondina 1 (1: 1000 dilución de 1 mg / ml stock), 100 ng Noggin / ml (1: 1000 dilución de 100 g / mL stock), 50 ng / ml EGF (dilución 1: 10.000 de 500 mg / ml stock), 500 nM A-83 -01 (1: 1000 dilución de 500 M stock), 10 mM SB202190 (1: 3000 dilución de 30 mM stock), 10 nM de [Leu] 15-gastrina 1 (dilución 1: 10.000 de 100 mu Mstock), nicotinamida 10 mM (dilución 1: 100 de 1 M) y 1 mM de N-acetilcisteína (1: 1000 dilución de 1 M). NOTA: Guarde medio completo minigut humanos hasta 2 días a 4 ° C sin pérdida de actividad. </li></ol> 2. Cripta aislados del Tejido NOTA: A partir de la recogida de tejido, es esencial para mantener la muestra en solución salina. Se recomienda mantener el tejido en hielo durante el transporte. Preparación de la muestra para el aislamiento de las criptas se debe realizar lo más pronto posible. NOTA: Todos los reactivos se enumeran en la Tabla 1, las herramientas, equipos y consumibles se enumeran en la Tabla 2. <ol><li> Preparar todos los reactivos antes de comenzar el experimento. Descongelar la matriz de la membrana basal en hielo y se pre-incubar una placa de 24 pocillos en un incubador de CO 2 a 37 ° C. NOTA: Alternativamente hacer una capa delgada de matriz de membrana basal utilizando 15 l / pocillo en el centro de un 24placa -bueno y colóquelo en una incubadora de CO 2 a 37 ° C. Este paso facultativa mantiene la matriz de membrana basal como una caída durante la polimerización. </li><li> Lavar el tejido con fosfato de Dulbecco solución salina tamponada sin Ca2 + y Mg2 + (DPBS) enfriado con hielo. Continúe hasta que el contenido de DPBS es clara. </li><li> Uso de 0,2 mm de diámetro pasadores minutien, asegurar el tejido en una placa de Petri de vidrio recubierto de silicona llena con DPBS enfriado con hielo. Estire y el pin del tejido plana con el lado de la mucosa hacia arriba. </li><li> Bajo un microscopio de disección, retire la mucosa suprayacente de la submucosa y el tejido conectivo con tijeras micro-disección y de punto fino curvas pinzas (Figura 2A, B). </li><li> Estirar y echar la diseccionado mucosa plana en el cristal Petri plato recubierto de silicona con el lado de la mucosa hacia arriba. La submucosa restante y el tejido conectivo pueden ser descartados o usados ​​para experimentos adicionales (Figura 2C). </li><li> Suavementeraspar la superficie de la mucosa con unas pinzas curvas. Este paso es necesario para mejorar la calidad de la preparación. <ol><li> Para intestino delgado, raspar suavemente la mucosa para eliminar las vellosidades. </li><li> Para colon, raspar suavemente la mucosa para eliminar la mucosa y los escombros. </li></ol></li><li> Lave la mucosa 3-4 veces con tampón de quelación helada para eliminar las vellosidades y escombros. </li><li> Cubrir la mucosa con tampón de quelación EDTA 2 mM recién preparada (200 l 0,5 M EDTA en 49,6 ml de tampón de quelación). </li><li> Coloque la placa de Petri en el hielo y agite suavemente durante 30 minutos en un agitador orbital horizontal. </li><li> Lave el tejido 3-4 veces con tampón de quelación helado sin EDTA. Después del lavado, dejar la mucosa en tampón de quelación enfriado con hielo. </li><li> Procesar la mucosa con un microscopio de disección utilizando pinzas curvas y finos. Raspar suavemente la mucosa para liberar criptas intestinales utilizando las pinzas curvas. </li><li> Retire con cuidado la suspensión cripta de la placa de Petri utilizando un pipette y la transfiere en un tubo cónico de 50 ml. NOTA: compruebe el tejido para asegurarse de que casi todas las criptas se han eliminado de la mucosa. </li><li> Se filtra la suspensión a través de criptas a 150 micras de malla 2 veces. NOTA: compruebe el flujo a través de enriquecimiento cripta bajo el microscopio (Figura 2D). </li><li> Centrifugar la cripta suspensión 5 min a 50 xg, 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en 5 ml de tampón enfriado con hielo quelación. </li><li> Cuente el número de criptas por 10 l gota de la suspensión del paso 2.15. Transferir el número de criptas necesarios para el recubrimiento de un 5 ml de tubos de fondo redondo. Use 200 a 500 criptas por pocillo de una placa de 24 pocillos para establecer enteroids o colonoids. </li><li> Centrifugar la fracción cripta durante 10 min a 150 g, 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Utilice criptas para el cultivo posterior. </li></ol> 3. Cripta Aislamiento de biopsia <ol><li> Preparar todos los reactivos antes de lainicio del experimento. Descongelar la matriz de la membrana basal en hielo y se pre-incubar una placa de 24 pocillos en un incubador de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Lavar la biopsia con fosfato de Dulbecco solución salina tamponada sin Ca2 + y Mg2 + (DPBS) enfriado con hielo. </li><li> Uso de 0,1 mm de diámetro pasadores minutien, asegure la biopsia en una placa de Petri de vidrio recubierto de silicona llena con DPBS enfriado con hielo. Estirar y el pin de la mucosa plana con el lado de la mucosa hacia arriba (Figura 2E). </li><li> Raspar suavemente la superficie de la mucosa con pinzas curvas para eliminar las vellosidades y escombros. Este paso es necesario para mejorar la calidad de la preparación. </li><li> Lave la biopsia 3-4 veces con tampón de quelación helada para eliminar las vellosidades y escombros. </li><li> Cubrir la biopsia con tampón de quelación EDTA 2 mM recién preparada (200 l 0,5 M EDTA en 49,8 ml de tampón de quelación). </li><li> Coloque la placa de Petri en el hielo y agite suavemente durante 30 minutos en un agitador orbital horizontal. </li> &lt;li&gt; Lave la biopsia de 3-4 veces con tampón de quelación helado sin EDTA. Después del lavado, dejar la biopsia en tampón de quelación enfriado con hielo. </li><li> Procesar la biopsia bajo un microscopio de disección utilizando pinzas curvas y finos. Raspar suavemente la mucosa para liberar las criptas intestinales utilizando pinzas curvas. </li><li> Retire suavemente la suspensión cripta de la placa de Petri con una pipeta y transferirlo a un tubo cónico de 50 ml. NOTA: compruebe el tejido para asegurarse de que casi todas las criptas se han eliminado de la mucosa. </li><li> Filtrar la suspensión cripta a través de un nylon de 150 micras de malla 2 veces. NOTA: compruebe el flujo a través de enriquecimiento cripta bajo el microscopio. </li><li> Centrifugar la cripta suspensión 5 min a 50 xg, 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en 1 ml de tampón de quelación enfriado con hielo. Transferir la suspensión cripta a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar la fracción cripta durante 10 min a 150 xg, 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. &lt;/ Li&gt; <li> Utilice criptas para el cultivo posterior. </li></ol> 4. Cripta Cultura en Sótano Matrix Membrana <ol><li> Utilizando puntas de pipeta preenfriados, resuspender el precipitado cripta (del paso 2.18 o 3.15) en el sótano matriz de la membrana (200 a 500 criptas / 50 l sótano matriz de la membrana). </li><li> Aplicar 50 l de suspensión cripta en la matriz de la membrana basal por pocillo en la placa de pre-calentado. Lentamente expulsar la matriz de la membrana basal en el centro del pozo. </li><li> Coloque la placa de 24 pocillos en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 30 min para permitir una polimerización completa de la matriz de la membrana basal. </li><li> Superposición de la matriz de la membrana basal con 500 l de medio de minigut humano completo suplementado con 2,5 mM CHIR99021 (1: 4000 dilución de almacén 10 mM) y 2,5 mM Thiazovivin (1: 4000 dilución de stock 10 mM). </li><li> Incubar la placa en un 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Sustituya el medio sens completo frescon minigut medio cada 2 días. </li></ol> 5. pases de Cultivadas Enteroids y Colonoids. NOTA: Paso Enteroids y Colonoids cada 7 a 10 días después de placas inicial. Generalmente, dividir un pocillo en 3 a 4 pozos. <ol><li> Preparar todos los reactivos antes del comienzo del experimento. Descongelar la matriz de la membrana basal en hielo y se pre-incubar una placa de 24 pocillos en un incubador de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Retire los medios de comunicación utilizando puntas estériles y superposición con 1 ml de DPBS heladas. </li><li> Pipeta de ida y vuelta con una punta de 1.000 l. Transferir la solución en un nuevo tubo cónico de 15 ml. </li><li> Añadir 2 ml de medio de minigut humano suplementado con FBS al 5% por 1 ml de medio. </li><li> Centrifugar la solución durante 5 min a 50 xg, 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento con 2 ml de la enzima de disociación celular suplementado con 10 mM Y-27632 (1: 1000 dilución de stock 10 mM). Incubar durante 5 men a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Disociar los grupos de células usando un 3 ml Luer-Lock jeringa equipada con una aguja de llenado 18-G / romo. Pipetear suavemente la solución de un lado a otro con la jeringa 10 veces. </li><li> Se centrifuga la suspensión durante 5 minutos a 500 xg, 4 ° C. Eliminar el sobrenadante. </li><li> Utilizando puntas de pipeta pre-refrigerados, resuspender el sedimento celular en la matriz de la membrana basal. </li><li> Aplicar 50 l de suspensión cripta en la matriz de la membrana basal por pocillo en la placa de pre-calentado. Lentamente expulsar la matriz de la membrana basal en el centro del pozo. </li><li> Coloque la placa de 24 pocillos en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 20 min para permitir una polimerización completa de la matriz de la membrana basal. </li><li> Superposición de la matriz de la membrana basal con 500 l de medio de minigut humano completo suplementado con 10 mM Y-27632 (1: 1000 dilución de stock 10 mM). </li><li> Incubar la placa en un 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Después de 2 días, Sustituir el medio con medio minigut humano completo fresco suplementado con 10 mM Y-27632 (1: 1000 dilución de stock 10 mM). A partir de entonces, sustituir el medio con medio minigut humana fresca, completa cada dos días. </li></ol> 6. Congelación de Cultivadas Enteroids y Colonoids NOTA: Por lo general, congelar un pozo en 2-3 crioviales. <ol><li> Repita los pasos 5.1 a 5.8. </li><li> Resuspender el pellet con medio de congelación frío. Transferencia de 1 ml de solución de congelación en un criovial etiquetado. Coloque el criovial en un recipiente de congelación que contiene 500 ml de alcohol isopropílico. </li><li> Transferir el contenedor de congelación a un congelador 80 ° C durante 24 h, a continuación, transferir criovial de almacenamiento de nitrógeno líquido. NOTA: Guarde Enteroids y Colonoids por hasta 1 año. </li></ol>

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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells.">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Exp Biol Med (Maywood). , (2014).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Kovbasnjuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids:+preclinical+models+of+non-inflammatory+diarrhea.">Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea.</a> Stem Cell Res Ther. 4, S3 (2013).</li><li>Fujii, M., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+intestinal+stem+cells:+applications+for+colorectal+cancer+research.">Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research.</a> Front Genet. 5, 169 (2014).</li><li>Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+gene+expression+control+in+primary+organoid+cultures.">Retroviral gene expression control in primary organoid cultures.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Este método proporciona un sistema completo de reproducción de linajes epiteliales intestinales y la dinámica epiteliales que constituyen una herramienta útil para estudiar la biología epitelial intestinal. El método presentado en este documento es una adaptación del estudio murino original por Sato y Clevers 22 que resulta eficiente en enteroids humanos y colonoids. Aquí, nos recogieron manualmente las criptas por microdisección para evitar contaminantes celulares. Este método permite una visualización directa de las criptas y conduce a las horas extraordinarias consistencia en comparación con la colección cripta original de &quot;agitación&quot;. Otros grupos desarrollaron técnicas similares utilizando enfoques ligeramente diferentes, especialmente la sustitución de la quelación con EDTA con colagenasa 25. Además de las diferencias en la recopilación de cripta, esas técnicas utilizan un medio definido que se requiere para crecer las enteroids humanas en cultivo 22. Para aumentar la eficiencia de crecimiento en la siembra cripta, añadimos un inhibidor de GSK3 (CHIR99021)durante los dos primeros días de 12. La manipulación del tejido o biopsias es importante y el aislamiento cripta debe realizarse tan pronto como llega el tejido en el laboratorio. Sin embargo, el retraso en el aislamiento y cultivo cripta se podían realizar hasta 24 horas después de la recogida de tejidos (datos no mostrados) como se describe previamente para el tejido murino 26. El tejido intestinal se debe colocar en un tubo cónico completamente lleno con DPBS para evitar la interrupción del tejido y debe mantenerse a 4 ° C. La preparación retardada permite el envío tejido, pero la variación de temperatura se debe evitar durante el transporte. El tiempo total necesario para el cultivo inicial cripta es de aproximadamente 2 horas con 15 a 30 min para procesar el tejido y de 1 a 2 horas para aislar y la placa de la cripta. La microdisección del tejido es un determinante crítico y el predicado de una preparación cripta limpio. Sin embargo, el comunicado de la cripta por agitación manual como se describe en varios protocolos es posible 22,23. A pesar de las similitudes con el sistema enteroide murino (enteroids), los enteroids humanos requieren moléculas específicas para mejorar y sostener su crecimiento en el tiempo. Los factores de crecimiento, EGF, Noggin, R-espondina se utilizan de manera similar a los organoides epiteliales murinas. Sin embargo, el uso de Wnt-3A es crítica. Hemos observado que la formación, así como la eficiencia de crecimiento es mayor utilizando un medio acondicionado Wnt-3A de la proteína recombinante humana. Al mismo tiempo, hemos demostrado la mejora de las condiciones de cultivo utilizando un inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa 3 (CHIR99021) 12. Factores de crecimiento recombinantes podrían ser reemplazadas por Wnt-3A, R-espondina, y Noggin acondicionado medios de comunicación. Una línea de células L Wnt-3A-expresión está disponible comercialmente (ATCC). Otros grupos han desarrollado R-espondina 1- 23,27, Noggin- 19, y Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 líneas celulares que expresan. Dos inhibidores de moléculas pequeñas se utilizan en la cultura mede diámetro y son necesarios para el mantenimiento de la cultura 29. A-83-01 es un inhibidor selectivo de la transformación del factor de crecimiento β y activina / receptores nodal (activina-quinasa como 4, 5, 7) y SB202190 es un inhibidor de la proteína quinasa activada por mitógenos p38 (MAPK). Tanto los inhibidores se han utilizado respectivamente para sostener inducidas pluripotentes células madre de auto-renovación humana y establecer células pluripotentes ingenuos humanos madre 30-32. Además, la nicotinamida, un precursor de la nicotinamida adenina dinucleótido, se requiere para mantener enteroids y expansión colonoids de una manera a largo plazo 22,29. La quelación con EDTA es un paso importante, ya que determina el rendimiento de la preparación cripta. Hemos tenido éxito con el tratamiento 2 mM EDTA. Sin embargo, la concentración de EDTA se puede modificar desde 2 mM a 15 mM con respecto al tipo de tejido. En ese caso, el tiempo de incubación tiene que ser determinado empíricamente. Después de la placa inicial, la cripta redondeará-up y, finalmente, forman enteroids. Sin embargo, los enteroids o colonoids menudo demuestran un fenotipo &quot;tallo&quot; mediante la formación de esferas con poco o nada de células diferenciadas. En ese caso, la diferenciación se puede iniciar mediante la retirada de Wnt-3A, la nicotinamida y el inhibidor de p38 MAPK. El uso de inhibidores de Notch como DAPT o DBZ ayuda a aumentar la diferenciación dentro de los enteroids 22. Este modelo recapitula la fisiología intestinal con los eventos de las criptas-ciernes continuas derivadas de un compartimento de células madre, así como dominios epiteliales de las vellosidades similares que contienen tanto de absorción y secretoras diferenciadas linajes. Curiosamente, este sistema no contiene células mesenquimales y utiliza condiciones de medios específicos para cumplir con los requisitos de la señal nicho. Al igual que el modelo murino, enteroids humanos pueden ser generados a partir de células epiteliales intestinales aislados para poner a prueba la capacidad de estas células para funcionar como una célula madre. SeveRAL estudios han utilizado grupo de marcadores de diferenciación (CD44, CD24 o CD166) y células positivas EPHB2 para enriquecer en células madre con propiedades 12,23,33. Juntos, estos estudios demuestran la utilidad de las culturas enteroids humanos para probar la stemness. Otros investigadores están utilizando este modelo para investigar las enfermedades intestinales, como enfermedades infecciosas diarreicas, la fibrosis quística, o cánceres colorrectales 22,34-37. Estos estudios demuestran que enteroids humanos constituyen un modelo fiable de la enfermedad humana, con la posibilidad de avanzar hacia una proyección personalizada. Enteroids humanos pueden ser modificados genéticamente mediante transfección de ADN o infección con partículas virales 38. Esto proporciona una poderosa herramienta para estudiar las funciones de genes específicos dentro de los organoides epiteliales humanas o mutaciones genéticas correctas. Recientemente, Schwank y sus colegas demostraron la posibilidad de editar el genoma con el sistema CRISPR / Cas9 y corregir la mutación en el gen CFTR que causa acfibrosis ystic 24. Enteroids humanos constituyen un sistema valioso para estudiar intestinal de células madre y la biología de la mucosa epitelial y servir como un novedoso sistema experimental para estudiar la fisiología gastrointestinal tanto normal como anormal.

El epitelio de revestimiento del tracto gastrointestinal está en constante renovación. Este proceso es activado por la proliferación de las células madre intestinales (SICS) que producen continuamente progenie para reemplazar rápidamente el epitelio intestinal, ya que da la vuelta. El compartimento proliferativo que comprende las ISC se limita a la parte inferior de las criptas. Los ISC dan lugar a la progenie que finalmente diferenciarse en linajes de absorción o secretoras. Salir de la cripta y en el epitelio de las vellosidades o superficie, las células se diferencian progresivamente a medida que migran hacia arriba antes de la exfoliación en el lumen 1. ISC dan lugar a todos los tipos de células epiteliales intestinales incluyendo los enterocitos, células de micropliegues, células enteroendocrinas, células caliciformes, células de mechones y células de Paneth. El colon se caracteriza por criptas alargados compuestos principalmente de colonocitos y células caliciformes, con enteroendocrinas dispersa y células penacho 2. Ex vivo culsistemas tura constituyen herramienta prometedora para el estudio de mantenimiento ISC y la homeostasis del tejido intestinal. Sin embargo, es difícil confiar en las tecnologías de cultivo de tejidos como condiciones fisiológicas no están completamente la reproducción y el microambiente epitelial menudo alterados 3,4. Un gran avance en el campo de ISC fue el establecimiento de técnicas de cultivo de tejidos para mantener y ampliar los CSI murinos individuales utilizando factores de crecimiento definidos para reemplazar las señales de nicho intestinal normal. Condiciones de cultivo a largo plazo fueron descritos por Sato et al., En el que criptas individuales o células madre aisladas de el epitelio intestinal crecen para formar estructuras epiteliales 3-dimensionales incluyendo múltiples dominios de cripta 5-7. Estas estructuras tridimensionales experimentan eventos de fisión para expandir continuamente. Curiosamente, se producen todos los tipos de células intestinales específicas para el tejido de origen y así se extruyen en un lumen 8. Utilizando modificaciones de este sistema, epitelialesorganoides se pueden generar desde el estómago, intestino delgado y colon. Más específicamente, organoides epiteliales de intestino delgado son enteroids 9, y los de colon son colonoids 9,10. Estos sistemas de cultivo de organoides epiteliales se han utilizado para probar la capacidad de las células individuales aisladas para funcionar como células madre in vitro, probando así la &quot;stemness&quot; de células aisladas 5,6,10-15. Otros investigadores han utilizado ambos enteroids y colonoids para estudiar la función de las células epiteliales individuales 16-21. Así, las culturas enteroide y colonoid pueden utilizarse para evaluar tanto las funciones de madre y de células no tallo y dar una nueva visión de las interacciones celulares fundamentales dentro de los intestinos. En 2011, Sato y sus colegas generaron cultivo a largo plazo de los organoides epiteliales derivadas de intestino delgado y colon 22,23 humano. Además de las diferencias en la composición de los medios de comunicación, los enteroids epiteliales humanasy colonoids exhiben las mismas características que su homólogo murino. Además, pueden generarse a partir de los tejidos enfermos, tales como el esófago, el adenoma o adenocarcinoma de Barrett, y la fibrosis quística 22,24. Enteroids humanos constituyen un sistema valioso para estudiar intestinal de células madre y la biología de la mucosa epitelial y servir como un novedoso sistema experimental para estudiar la fisiología gastrointestinal normal y anormal 3. Aquí se describen los métodos para establecer enteroids y colonoids de intestino delgado humano y criptas del colon (Figura 1). En esta revisión metodológica, destacamos la colección cripta de todo el tejido y biopsias. Nos Recapitulemos las modalidades de cultivo que son esenciales para el crecimiento y mantenimiento de enteroids y colonoids humanos y las posibles estrategias experimentales llevadas a cabo por este exitoso modelo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:480px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP439-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gzntamycin/Amphotericin B solution</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>R-015-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wnt-3A conditionned medium</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES 1M</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Supplement</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotidamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>6057-NG/CF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant R-Spondin</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>120-38</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant EGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644-.2MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-5MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human [Leu]15-Gastrin 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145-.1MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiazovivin</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>10082-147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>A13713-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L Wnt-3A cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Renilla luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2710</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant Wnt-3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN/CF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HEK293 TOPflash cell line</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

La Figura 2D muestra un ejemplo típico de las criptas recién aisladas de tejido completo (Figura 2D). El número de criptas aisladas a partir de una biopsia es menor que en todo el tejido. Con unas pinzas de biopsia capacidad estándar con aguja, normalmente realizamos dos bocados de biopsia en una sola pasada. Cada resultados de la biopsia de la mordedura en una superficie de 10 mm 2 con un promedio de 50 a 100 criptas por biopsia (Figura 2F). Después de la cultura en la matriz de la membrana basal, las criptas completan para formar enterospheres de intestino delgado y colonospheres de colon. La cripta de florecimiento ocurre generalmente dentro de 5 a 6 días, después de la siembra. Sin embargo, no es raro ver a cualquiera enteroids (enteroids) o colonoids (colonoids) que forman esferas en la matriz de la membrana basal (Figura 3A-C; Movie 1). El pases se puede hacer después de 7 días, dependiendo del tamaño de los enteroids. El enteroids o colonoids establISHED de biopsias sufren el mismo desarrollo en la cultura. Sin embargo, como la densidad cripta de siembra es menor, el pases se realiza generalmente después de 10 a 12 días en cultivo (Figura 4a, b). Enteroids y culturas colonoids se expanden de una manera reproducible. Ambos enteroids y colonoids presentan un lado luminal y se alinean con un epitelio (Figura 5A, B). Células proliferativas se pueden observar dentro de los enteroids y se encuentran dentro de las puntas de yemas (Figura 5C, D). Imagen confocal de enteroids teñidas con E-cadherina (cadE) muestra las células epiteliales (Figura 5E). Ambos enteroids y colonoids se pueden establecer a partir de tejido obtenidas de pacientes con trastornos genéticos / congénitas. La Figura 6 muestra enteroids representativos de crecimiento de un paciente con fibrosis quística (Figura 6A) y una enteropatía tufting debido a una mutación congénita en el anuncio de células epitelialesgen molécula cohe- (EpCAM) (Figura 6B). Al lado del defecto genético, los enteroids no muestran diferencias en la condición basal. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig1highres.jpg" /> Figura 1. Flujo de trabajo de las criptas disociación y la generación de enteroids humanos y colonoids en cultivo. Criptas (de intestino delgado o el colon humano) están aislados por quelación con EDTA. Criptas cultivadas forman enteroids para el intestino delgado y colonoids para el colon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig2highres.jpg" /> Figura 2. proceso de disección para el aislamiento cripta. (A) El pequeño specime intestinon se estira y se fijó plano en una placa de Petri recubierta de silicona. (B) La mucosa se ​​separa de la submucosa subyacente. (C) La mucosa diseccionado se estira y se fijó plano en una placa de Petri recubierta de silicona. (D) Después de quelación con EDTA, las criptas están aislados del tejido. (E) Una biopsia se estira y se fijó plano en una placa de Petri recubierta de silicona. (F) Después de la quelación con EDTA, criptas están aislados de la biopsia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig3highres.jpg" /> Figura 3. cultura Cripta y enteroide humano y la generación colonoid de todo el tejido. (A) criptas yeyunal chapados en la matriz de la membrana basal después del aislamiento. Las criptas están cerrando después de 3 a 4 horas y se empiezan a hinchar hasta formar enterospheres más allá de este tiempo. A los 7 días, se forman los enteroids yeyunales. (B) Después del aislamiento y la cultura, criptas ileales se comportan como las criptas del yeyuno y forman enteroids ileal. (C) criptas colónicas se siembran en la matriz de la membrana basal después del aislamiento. Las criptas colonoids cercanos y formar después de 7 días (barras de escala: 100 micras). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig4highres.jpg" /> Figura 4. cultura Cripta y enteroide humano y la generación colonoid de biopsia. (A) criptas duodenales chapados en la matriz de la membrana basal después del aislamiento. Las criptas están cerrando después de 3 a 4 horas y se comienzan a inflarse beyond esta vez para formar enterospheres. A los 7 días, se forman los enteroids. (B) Después del aislamiento y de la cultura, las criptas del colon se siembran en la matriz de la membrana basal. Las criptas de cerca para formar colonospheres entonces colonoids después de 7 días (barras de escala: 100 micras). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig5highres.jpg" /> Figura 5. intestinales linajes de los enteroids humanos. (A) enteroide humano después de 6 días de cultivo. (Las barras de escala: 100 micras) secciones hematoxilina-eosina de los enteroids en (A) demostrar el epitelio de revestimiento (B). (CD) de formación de imágenes confocal de enteroids Después de la tinción EdU (magenta) muestra la presencia de células proliferativas. (E </strong&gt;) Confocal de imágenes de enteroids demuestra la presencia de: E-cadherina en las células epiteliales (ECAD, verde) (barra de escala:. 50 micras) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig6highres.jpg" /> Figura 6. cripta cultura y la generación de enteroide humano a partir de tejido enfermo. (A) Enteroids establecieron a partir de una muestra de fibrosis quística. (B) Enteroids establecieron a partir de una muestra congénitas enteropatía insertar mechones (barras de escala: 100 micras). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Película 1. Enterosphere formando enteroide humana en la cultura. 32 h de tiempo de vueltase grabación muestra un enterosphere establecido a partir de intestino delgado humano retraer para formar una enteroide en la cultura. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/Movie1_v2.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nombre de Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Solvente </td><td> Stock Concentración </td><td> Concentración final </td><td> Comentario </td></tr><tr><td> Fosfato de Dulbecco tamponada salina Ca 2+, Mg 2+ libre (DPBS) </td><td> Tecnologías de la vida; Gibco </td><td> 14190-144 </td><td> - </td><td> - </td><td> 1x </td><td></td></tr><tr><td> Etilendiamina ácido tetraacético (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 431788 </td><td> Ultrapura H2Od </td><td&gt; 0,5 M </td><td> 2 mM </td><td></td></tr><tr><td> Sorbitol </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP439-500 </td><td> DPBS </td><td> Polvo </td><td> 2% </td><td></td></tr><tr><td> La sacarosa </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP220-1 </td><td> DPBS </td><td> Polvo </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> Albúmina de suero bovino (BSA) fracción V </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> DPBS </td><td> Polvo </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> Solución Gzntamycin / anfotericina B </td><td> Tecnologías de la vida; Gibco </td><td> R-015 a 10 </td><td> - </td><td> 500x </td><td> 1x </td><td></td></tr><tr><td> Wnt-3A acondicionado en toda medio </td><td> en casa </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Advanced DMEM / F12 </td><td> Tecnologías de la vida; Gibco </td><td> 12634-028 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Tecnologías de la vida; Gibco </td><td> 15630-080 </td><td> - </td><td> 1 M </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX (glutamina) </td><td> Tecnologías de la vida; Gibco </td><td> 35050-061 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina (10.000 U / ml) </td><td> Tecnologías de la vida; Gibco </td><td> 15140-148 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N2 Suplemento </td><td> Tecnologías de la vida; Gibco </td><td> 17502-048 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> B27 Suplemento </td><td> Tecnologías de la vida; Gibco </td><td> 17504-044 </td><td> - </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N-acetilcisteína </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9165-5G </td><td> DPBS </td><td> 1 M </td><td> 1 mM </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Nicotidamide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N0636 </td><td> DPBS </td><td> 1 M </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel, TFG, Fenol (matriz de membrana basal) gratis </td><td> Corning </td><td> 356231 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> SE REQUIERE </td></tr><tr><td> Noggin recombinante humana </td><td> I + D </td><td> 6057-NG / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 mg / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td rowspan="3"> Otros proveedores: I + D; Anaspec y Preprotech </td></tr><tr><td> humana recombinante R-Spondin </td><td> Preprotech </td><td> 120-38 </td><td> DPBS </td><td> 1 mg / ml </td><td> 1 mg / ml </td></tr><tr><td> EGF humano recombinante </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9644-.2mg </td><td> SPD </td><td> 500 mg / ml </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Y0503-1MG </td><td> DPBS </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> A-83-01 </td><td> Tocris </td><td> 2939 </td><td> DMSO </td><td> 500 mM </td><td> 500 nM </td><td></td></tr><tr><td> SB202190 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7067-5MG </td><td> DMSO </td><td> 30 mM </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> humana [Leu] 15-gastrina 1 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9145-.1MG </td><td> DPBS </td><td> 100 mu M </td><td> 10 nM </td><td></td></tr><tr><td> CHIR99021 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0004 </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 2,5 mM </td><td></td></tr><tr><td> Thiazovivin </td><td> Stemgent </td><td> 04-0017 </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 2,5 mM </td><td></td></tr><tr><td> TrypLE expreso Enzyme (1X), rojo fenol (enzima de disociación celular) </td><td> Tecnologías de la vida; Gibco </td><td> 12605-010 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Para passaging </td></tr><tr><td> Suero bovino fetal </td><td> Tecnologías de la vida; Gibco </td><td> 10082-147 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Para passaging </td></tr><tr><td> CTS Synth-a-Freeze (medio de congelación) Medio </td><td> Tecnologías de la vida; Gibco </td><td> A13713-01 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Para la congelación </td></tr><tr><td> Línea celular L Wnt-3A </td><td> ATCC </td><td> CRL-2647 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A acondicionado en toda la producción de los medios </td></tr><tr><td> Ensayo de luciferasa Renilla </td><td> Promega </td><td> E2710 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A acondicionado en toda la actividad de los medios </td></tr><tr><td> humana recombinante Wnt-3A </td><td> I + D </td><td> 5036-WN / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 mg / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td&gt; Wnt-3A climatizado actividad de los medios </td></tr><tr><td> Línea celular HEK293 TOPflash </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A acondicionado en toda la actividad de los medios; Regalo del laboratorio Hans Clevers </td></tr></tbody></table> Tabla 1. reactivo lista detallada con el fabricante preferido y el número de catálogo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Equipo </td><td> Consumible </td><td> Instrumentos </td></tr><tr><td> Campana de flujo laminar </td><td> De 15 y 50 ml tubos cónicos </td><td> Dumont # 5 pinzas estándar (FST; # 11251-20) </td></tr><tr><td> CO 2 incubadora </td><td> Tubos de microcentrífuga </td><td> Dumont # 7, pinzas finas curvas (FST; # 11274-20) </td></tr><tr><td> Estereomicroscopio </td><td> Placas de 24 pocillos </td><td> Bellas tijeras (FST; # 14060-09) </td></tr><tr&gt; <td> Centrífugo </td><td> 0,22 micras (Sartorius) filtros </td><td> Tijeras de primavera Vannas (FST; # 15018-10) </td></tr><tr><td> Agitador orbital </td><td> Pipetas serológicas </td><td> Pasadores de diámetro minutien 0.2 mm (FST; # 26002-20) </td></tr><tr><td> Contenedor de congelación (Nalgene) </td><td> Puntas de micropipeta </td><td> Pasadores de diámetro minutien 0.1 mm (FST; # 26002-10) </td></tr><tr><td> Sylgard 184 de silicona (Dow Corning) </td><td> 150 micras aberturas de la malla, la detección de nylon (Dynamic Aqua-oferta) </td><td></td></tr><tr><td> Plato de cristal Petri </td><td> 5 ml tubos de polipropileno de fondo redondo (Falcon) </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta serológica </td><td> 18G aguja de llenado romo (BD) </td><td></td></tr><tr><td> Micropipetas </td><td> 3 ml lsyringes con puntas Luer-Lock (BD) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Crioviales </td><td></td></tr></tbody></table><strong&gt; Tabla 2. detallada consumibles, herramientas y equipos necesarios para el aislamiento y cultivo cripta.

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Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Establecimiento de Human epitelial Enteroids y Colonoids de Whole Tejidos y Biopsia

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

establishment-human-epithelial-enteroids-colonoids-from-whole-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

34.4K vistas.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

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Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Establecimiento y propagación de los tumores del retinoblastoma humanos en ratones con deficiencia inmune

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Investigación

Medicina

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

En tiempo real Ensayos de citotoxicidad en sangre entera humana

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

El aislamiento y la inmortalización de líneas celulares derivados de los pacientes a partir de una biopsia muscular para Modelado de Enfermedades

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

Evaluación de Preparación y respirometría de mitocondrias aisladas de tejido músculo esquelético Obtenidos percutánea Biopsia con aguja

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

Humano<em&gt; vasto externo</em&gt; Esquelético biopsia muscular utilizando el Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

El análisis del tejido de miocardio entero en 3D del corazón

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To obtain subcutaneous adipose tissue biopsies in the abdominal area, researchers and physicians use either a surgical or a needle-based technique. However, surgical subcutaneous fat biopsies can offer tissue samples that may provide a more comprehensive overview of the complexities of biological indices in white adipose tissue. Usually, a surgical adipose tissue biopsy includes a diathermy treatment for cauterizing blood vessels to prevent excessive bleeding. Nevertheless, side effects, such as flash fires and skin lesions in the tissue, have been reported after diathermy. Therefore, we aimed to standardize a surgical abdominal adipose tissue biopsy performed under local anesthesia using a non-diathermy method. We conducted 115 subcutaneous adipose tissue biopsies in healthy men using a non-diathermy abdominal surgical biopsy method. Our results showed three cases of excessive post-operation bleeding out of 115 operations (2.61%).In conclusion, our standardized subcutaneous abdominal adipose tissue surgical biopsy using a non-diathermy method can be safely applied to healthy men at the bedside, with minimal side effects.

We standardized an abdominal adipose tissue biopsy using a non-diathermy method performed under local anesthesia. Three cases of excessive post-operation bleeding out of 115 operations (2.61%) occurred.We conclude that an abdominal adipose tissue surgical biopsy using a non-diathermy method can be safely applied to healthy men.

Una técnica para biopsia de tejido adiposo Abdominal subcutáneo mediante un método no-diatermia

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to expend energy has made it a potential target for novel therapies to ameliorate obesity and associated metabolic disorders in humans. Though this tissue has been well studied in small animals, BAT&#39;s thermogenic capacity in humans remains largely unknown due to the difficulties of measuring its volume, activity, and distribution. Identifying and quantifying active human BAT is commonly performed using 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography and computed tomography (PET/CT) scans following cold-exposure or pharmacological activation. Here we describe a detailed image-analysis approach to quantify total-body human BAT from 18F-FDG PET/CT scans using an open-source software. We demonstrate the drawing of user-specified regions of interest to identify metabolically active adipose tissue while avoiding common non-BAT tissues, to measure BAT volume and activity, and to further characterize its anatomical distribution. Although this rigorous approach is time-consuming, we believe it will ultimately provide a foundation to develop future automated BAT quantification algorithms.

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Using free, open-source software, we have developed an analytical approach to quantify total and regional brown adipose tissue (BAT) volume and metabolic activity of BAT using 18F-FDG PET/CT.

Cuerpo entero y cuantificación Regional de activo humano marrón tejido adiposo utilizando 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activity and restoration from small molecule compounds. Our group recently focused on establishing a well-differentiated organoid model directly derived from primary human nasal epithelial cells (HNE). Histology of sectioned organoids, whole-mount immunofluorescent staining, and imaging (using confocal microscopy, immunofluorescent microscopy, and bright field) are essential to characterize organoids and confirm epithelial differentiation in preparation for functional assays. Furthermore, HNE organoids produce lumens of varying sizes that correlate with CFTR activity, distinguishing between CF and non-CF organoids. In this manuscript, the methodology for culturing HNE organoids are described in detail, focusing on the assessment of differentiation using the imaging modalities, including the measurement of baseline lumen area (a method of CFTR activity measurement in organoids that any laboratory with a microscope can employ) as well as the developed automated approach to a functional assay (which requires more specialized equipment).

A detailed protocol is presented here to describe an in vitro organoid model from human nasal epithelial cells. The protocol has options for measurements requiring standard laboratory equipment, with additional possibilities for specialized equipment and software.

Cultivo e imágenes de organoides epiteliales nasales humanos

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Testing Epithelial Permeability in Fetal Tissue-Derived Enteroids

Human fetal tissue-derived enteroids are emerging as a promising in vitro model to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids exhibit polarity, consisting of a lumen with an apical border, tight junctions, and a basolateral outer layer exposed to growth media. The consequences of intestinal injuries include mucosal inflammation and increased permeability. Testing intestinal permeability in vulnerable preterm human subjects is often not feasible. Thus, an in vitro fetal tissue-derived intestinal model is needed to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids can be used to test changes in epithelial permeability regulated by tight junction proteins. In enteroids, intestinal stem cells differentiate into all epithelial cell types and form a three-dimensional structure on a basement membrane matrix secreted by mouse sarcoma cells. In this article, we describe the methods used for establishing enteroids from fetal intestinal tissue, characterizing the enteroid tight junction proteins with immunofluorescent imaging, and testing epithelial permeability. As gram-negative dominant bacterial dysbiosis is a known risk factor for intestinal injury, we used lipopolysaccharide (LPS), an endotoxin produced by gram-negative bacteria, to induce permeability in the enteroids. Fluorescein-labeled dextran was microinjected into the enteroid lumen, and serial dextran concentrations leaked into the culture media were measured to quantify the changes in paracellular permeability. The experiment showed that apical exposure to LPS induces epithelial permeability in a concentration-dependent manner. These findings support the hypothesis that gram-negative dominant dysbiosis contributes to the mechanism of intestinal injury in preterm infants.

This protocol details the establishment of enteroids, a three-dimensional intestinal model, from fetal intestinal tissue. Immunofluorescent imaging of epithelial biomarkers was used for model characterization. Apical exposure of lipopolysaccharides, a bacterial endotoxin, using microinjection technique induced epithelial permeability in a dose-dependent manner measured by the leakage of fluorescent dextran.