El objetivo general del siguiente artículo del método es demostrar un protocolo útil para estudiar las interacciones del ARN con proteínas u otros factores utilizando pinzas ópticas junto con microscopía confocal. Durante la última década, se han desarrollado varias técnicas sofisticadas para investigar las propiedades de macromoléculas individuales. Una de estas técnicas son las pinzas ópticas de una sola molécula.
Con las nuevas pinzas ópticas asistidas por fluorescencia, no solo se pueden monitorear en detalle las fuerzas requeridas para el despliegue de las moléculas de ARN, así como los eventos de unión durante la traducción. Aquí nos centramos en las mediciones en las que las moléculas de ARN se estiran con y sin factores transaccionales que regulan la traducción. También ilustramos cómo se puede aplicar la técnica para monitorear la traducción utilizando ribosomas etiquetados.
El protocolo será demostrado por dos estudiantes graduados de mi grupo, Lukas Pekarek y Stefan Park. En este video, lo guiaremos a través de la configuración y ejecución de un experimento de pinzas ópticas. También describimos el flujo de trabajo de análisis de datos simple.
La ventaja de esta técnica es que es sencilla y robusta. Una molécula está atada entre dos cuentas, atada al foco de los rayos láser, y el cambio y la fuerza sobre el desplazamiento se pueden medir con precisión en los llamados experimentos de rampa de fuerza. Las estructuras secundarias dentro de una correa se despliegan a una cierta fuerza dependiendo de la energía interna de la molécula.
Esta transición dinámica entre múltiples estructuras se puede investigar más a fondo con mediciones de fuerza constantes. Además, el uso paralelo de imágenes fluorescentes se puede utilizar para visualizar eventos de unión en tiempo real. Un perfil de fuerza-distancia distinto de una correa puede variar después de la unión de posibles factores de transacción que influyen en su estabilidad.
Primero, el ARN de interés tiene que ser clonado en un vector de ADN. Aguas arriba y aguas abajo de esta secuencia, se necesitan partes adicionales, los mangos para atar la construcción final de ADN-ARN entre las cuentas. Después de la clonación y amplificación exitosa del plásmido, se realizan tres reacciones diferentes de PCR.
Para cada reacción de PCR, mezcle los reactivos de acuerdo con la tabla uno del protocolo. Ejecute la PCR en alícuotas de 50 microlitros en un termociclador apropiado. El primero da como resultado un ADN de doble cadena de todo el constructo con el promotor T7 para su posterior transcripción in vitro.
La segunda PCR produce los cinco mangos principales. Mientras que la última reacción da como resultado los tres mangos principales. Tanto los mangos primos como los 3 primos deben etiquetarse de acuerdo con las cuentas utilizadas.
Los tres mangos principales se etiquetan durante la PCR mediante el uso de una imprimación inversa marcada con digoxigenina, y los cinco mangos principales deben etiquetarse en un paso adicional a través de la biotinilación. La biotinilación de tres primos de los cinco mangos primarios se realiza utilizando T 40 y una polimerasa. La reacción se realiza durante una o dos horas a temperatura ambiente.
A continuación, realizar la transcripción in vitro utilizando la polimerasa T7. Incubar la reacción a 37 grados durante dos a cuatro horas, dependiendo de la longitud del ARN. En un último paso, los mangos se recocen con el ARN de la transcripción in vitro para obtener la construcción final ADN-ARN con la región de interés de cadena simple entre los mangos de doble cadena.
Para recocir el híbrido ARN-ADN deseado, mezcle los mangos y el ARN en un tampón de recocido. Calentar, la mezcla de recocido hasta 85 grados durante 10 minutos, y luego enfriar lentamente la muestra a cuatro grados. Mezcle la muestra recocida con 1/10 de volumen de acetato de sodio molar y tres volúmenes de etanol helado e incube menos 80 grados durante al menos una hora.
Centrifugar las muestras a 15, 000 xg durante 30 minutos a cuatro grados. Deseche el sobrenadante y seque el pellet al vacío. Las pequeñas alícuotas del pellet resuspendido se congelan en nitrógeno líquido y se mantienen a menos 80 grados hasta que se utilizan.
Primero retire la lejía de las jeringas y llene un ml de agua libre de RNasa. Agregue 50 microlitros de tiosulfato de sodio molar 0.5 y lave el sistema con una barra. Tenga cuidado de que el sistema microfluídico nunca se seque para evitar burbujas de aire en el sistema.
A continuación, deseche la solución de tiosulfato de sodio restante y reemplace las jeringas por otras nuevas. Luego lavar de nuevo con al menos 0,5 ml de agua libre de RNasa. Para configurar el sistema óptico de la máquina, coloque dos gotas de aceite de inmersión en el objetivo.
Coloque la celda de flujo en su lugar y eleve el objetivo hasta que el líquido toque la celda de flujo. Luego coloque dos gotas de aceite de inmersión en la parte superior de la celda de flujo. Ahora encienda la unidad de dirección de la trampa y el láser de captura.
El objetivo se ajusta utilizando la herramienta de búsqueda Z de las cámaras de diagnóstico de la máquina. Al girar el micro tornillo, el eje Z se ajusta al centro de la cámara entre la segunda y la tercera reflexión. Donde los anillos de refracción son los más grandes.
Cambie las cámaras de diagnóstico al modo lunar y reduzca el láser de captura a alrededor del 50%Luego baje el condensador y ajuste su posición para que vea aproximadamente 10 bandas de luz. La cámara de medición tiene cinco canales, y antes del experimento, se deben considerar diferentes posibilidades de configuración. Para un experimento simple de rampa de fuerza, las cuentas-búfer-perlas son una disposición de canal conveniente.
Para las mediciones con el cuarto compuesto, como los ribosomas fluorescentes o los factores de transacción, el factor de amortiguación de cuentas-cuentas es una mejor disposición, pero hace que sea más difícil atrapar cuentas. Una alícuota de la construcción recocida se incuba con tres microlitros de suspensión de perlas AD, un inhibidor de la RNasa de microlitros y ocho microlitros del tampón de ensayo a temperatura ambiente durante 10 a 20 minutos. Luego, la muestra se diluye en un tampón de ensayo de 500 microlitros y se coloca en el canal respectivo.
Para el segundo tipo de perlas, 0,8 microlitros de cuentas de ensayo se mezclan con un ml de tampón de ensayo y se administran en el canal correspondiente. Los canales se abren y se lavan con baja presión. Ahora encienda el láser de captura.
Para atrapar cuentas, los láseres se separan entre sí y una cuenta AD queda atrapada en la trampa uno. A continuación, la etapa se traslada al canal de cuentas SA y una cuenta queda atrapada en la trampa dos. Para evitar perder las cuentas, o para atrapar una segunda en la misma trampa, la etapa se mueve al canal de amortiguación y todos los canales se cierran.
En el búfer, se realiza una calibración de trampa. Las cuentas capturadas deben establecerse como plantillas visuales para mediciones posteriores. Y la puntuación de similitud debe mantenerse por encima del 90% entre las mediciones para garantizar la comparabilidad.
Finalmente, las cuentas se acercan más y uno puede comenzar a atrapar una sola correa. Esto se hace moviendo las cuentas cerca durante unos segundos y luego lentamente salen de las cuentas nuevamente. Una formación de atadura resulta en un aumento de la fuerza medida al alejar las dos cuentas una de la otra.
El número y la calidad de las correas se pueden verificar encontrando la meseta de estiramiento excesivo y comparando la trayectoria con la cadena libremente articulada o el modelo de cadena similar a un gusano. La meseta de estiramiento excesivo debe estar entre 50 y 60 piconewton para una sola correa. Para realizar las mediciones de fluorescencia, encienda los láseres confocales y cuente con fotones en la unidad y la máquina de pinzas ópticas.
Luego, encienda el láser de excitación de la longitud de onda deseada y la interfaz del software y ajuste la potencia del láser al 5% o más, dependiendo del fluoróforo. Ahora las imágenes se pueden iniciar utilizando las funciones de imagen o kymograph del software. Para obtener imágenes bien enfocadas, asegúrese de que el plano focal del microscopio confocal y las trampas ópticas estén alineados.
Para este propósito, se puede emplear la autofluorescencia de las perlas de poliestireno en el canal láser azul. Muévete hacia arriba y hacia abajo con el plano focal de las trampas ópticas hasta que la autofluorescencia de las perlas alcance su diámetro más alto. En esta posición, se pueden detectar las señales de fluorescencia que tienen lugar en la molécula atada.
Para ambas funciones es importante seleccionar las regiones de interés apropiadas. A lo largo de la composición del tampón de medición se puede cambiar fácilmente moviendo las perlas a diferentes canales o cambiando el búfer suministrado en el sistema microfluídico. Para evitar el fotoblanqueo, siempre apague el láser de excitación cuando no esté midiendo.
La salida de datos sin procesar del dispositivo a menudo contiene mucho ruido. Por lo tanto, para analizar más a fondo los datos dispersos, primero hay que preprocesarlos. El primer paso es bajar la muestra y filtrar los datos con el filtro Butterworth de paso bajo, se obtuvieron buenos resultados.
Para los experimentos de rampa de fuerza, los eventos de despliegue deben marcarse en las regiones plegadas y desplegadas correspondientes de la primera curva de distancia que se pueden instalar utilizando una cadena similar a un gusano o modelos de cadena libremente articulados. Para los datos de fuerza constante, se puede trazar la distancia a lo largo del tiempo y es útil generar un histograma para cuantificar la conformación predominante a una fuerza dada. Aquí se muestra que los parámetros del filtro son cruciales para distinguir diferentes estados de plegado.
Para comprender mejor lo que se puede lograr con esta técnica, se muestran algunos resultados representativos. Así es como se ve una curva de fuerza-distancia estándar de un experimento de rampa de fuerza. En este caso, estudiamos el elemento de cambio de marco SARS-coronavirus-2.
Observamos el despliegue en múltiples pasos alrededor de 15 piconewton. Cuando la dirección se invierte y las cuentas se acercan de nuevo, la correa se vuelve a plegar a una fuerza ligeramente menor. Cuando medimos el mismo ARN en presencia de la proteína antiviral del dedo de zinc ZAP, se observó un patrón similar de despliegue.
Pero la estructura secundaria del ARN no se replegó. Este es un buen ejemplo para mostrar la gran influencia que la unión a proteínas puede tener en la cinética del ARN. Al observar los datos de fuerza constante, la cinética de despliegue se puede investigar más a fondo.
La distancia a lo largo del tiempo se traza para diferentes fuerzas y el histograma de los diferentes estados observados se agrega a la derecha. A 10 piconewton, el ARN está completamente en estado plegado. A 11,5 piconewton cambia entre estados, y a 13 piconewton el ARN está permanentemente en un estado desplegado.
Sin embargo, cuando el elemento de desplazamiento de trama SARS-coronavirus-2 se midió junto con ZAP, el ARN estaba completamente en un estado desplegado a 11 piconewton, e incluso mostró muy poca transición hacia un estado plegado a 10 piconewton. Esto indica que ZAP se une al elemento de desplazamiento de marco de una sola hebra y evita la formación de una estructura secundaria. Finalmente, veremos algunos datos de pinzas ópticas junto con microscopía confocal.
En este experimento, se utilizó un tinte fluorescente que etiqueta ácidos nucleicos de doble cadena, no específicamente con fuerza creciente. El kymograph muestra que a medida que las cuentas se separan entre sí, la intensidad de la fluorescencia aumenta y desaparece por completo una vez que la correa se estira demasiado y se rompe. En la última figura se añadieron ribosomas marcados fluorescentemente a través del canal cuatro.
En este experimento se observó una unión específica del ribosoma a la correa de ARN. Esperamos que este video te haya dado una idea de las pinzas ópticas y lo que se puede realizar esta increíble técnica.
