Este protocolo de extracción de ADN basado en perlas magnéticas económico hace que la secuenciación de alto rendimiento sea accesible para laboratorios y estudios de recursos limitados. Este protocolo no requiere equipos costosos para la extracción de ADN de alta calidad y puede ser útil en ciertas situaciones de diagnóstico o investigación donde la obtención de una cantidad suficiente de ADN con una calidad para la secuenciación de alto rendimiento es un desafío. Este protocolo es fácil de replicar con una demostración única.
Primero se debe probar con un pequeño número de muestras para familiarizarse con el flujo de trabajo. Para empezar, hidratar las muestras de tejido del mosquito almacenadas en más del 70% de alcohol añadiendo 100 microlitros de agua de grado PCR e incubando durante una hora a cuatro grados centígrados para ablandar el tejido. Después de la incubación, deseche el agua y agregue 100 microlitros de la mezcla de enzimas tampón proteinasa K.
A continuación, utilice un tubo de microcentrífuga pestle para homogeneizar el tejido. Después de la homogeneización, centrífuga el tejido se liste e incuba durante dos o tres horas a 56 grados centígrados. Para extraer el ADN, pipetear 100 microlitros del tejido se listan en un nuevo tubo de microcentrífuga limpia.
A continuación, agregue 215 microlitros de la mezcla maestra de cuentas magnéticas. Usando una pipeta, mezcle el lisato y la mezcla de perlas magnéticas durante 10 a 20 segundos, luego déjelo reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Durante la incubación, agite suavemente el tubo de vez en cuando para maximizar la unión del ADN a las perlas magnéticas.
A continuación, coloque el tubo en el separador de perlas magnéticas hasta que la solución se aclare. Luego, usando una pipeta, aspire suavemente el líquido del tubo sin perturbar las perlas magnéticas que sostienen el ADN. Aleje el tubo del separador magnético de perlas y lave las perlas agregando 325 microlitros de amortiguación de lavado uno.
Mezclar bien por pipeteo e incubar durante un minuto a temperatura ambiente. Después de la incubación, coloque el tubo en el separador de perlas magnéticas y retire el sobrenadante como se demostró anteriormente, luego aleje el tubo del separador de perlas magnéticas y lave las perlas una vez con el tampón de lavado uno. Después del segundo lavado con tampón uno, lave las cuentas dos veces con 250 microlitros de tampón de lavado dos de la misma manera.
Después del último lavado, aleje el tubo del separador magnético de perlas y agregue 100 microlitros de tampón de elución. Mezcle bien por pipeteo y luego incube el tubo durante dos minutos a temperatura ambiente antes de colocarlo de nuevo en el separador magnético. Cuando la solución se aclare, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitros limpio y guárdelo adecuadamente.
Se muestra aquí como una lectura típica del fluorómetro de microvolumen del ADN del mosquito en un tampón de elución que contiene EDTA de 0,5 milimolares. La relación de absorbancia promedio de 260 a 280 nanómetros es de 2,3. Esta tabla muestra los costos y el número de muestras procesadas en un día hábil para diferentes métodos de extracción.
El costo típico de reactivos y consumibles para una extracción por este protocolo es de alrededor de 9.50 por muestra. Este costo es equivalente a cualquier método típico de extracción basado en perlas magnéticas. El mayor costo beneficio de este protocolo proviene de no requerir el instrumento automatizado de extracción de ADN.
Asegúrese de cambiar las puntas de las pipetas entre las muestras para evitar la contaminación cruzada del ADN cuando trabaje con varias muestras. Utilizamos el ADN de alta calidad extraído utilizando este método para la secuenciación del genoma completo. Actualmente estamos utilizando los datos de secuenciación para identificar nuevas mutaciones en la resistencia a los insecticidas o genes inmunes de interés en la salud pública y el control de enfermedades.
Tener soluciones asequibles para la secuenciación de alto rendimiento abre puertas emocionantes para la genómica de poblaciones y la genómica del paisaje con el objetivo de comprender la dispersión de mosquitos y el flujo de genes que influye en el éxito de muchas estrategias novedosas de control genético.
