Este protocolo detalla un método para generar una población bien caracterizada de células endoteliales hemogénicas humanas. Estas células se pueden utilizar para estudiar la regulación molecular y la transición endotelial a hematopoyética. Comience cultivando células madre embrionarias humanas durante cuatro días para diferenciarlas en células endoteliales primordiales.
En el día cinco, aspirar el medio por encima de las células. Luego lave suavemente las células con un mililitro de DMEM / F-12 por pocillo. Agregue un mililitro de medio de diferenciación de células endoteliales hemogénicas recién preparado por pocillo e incube las células durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.
En el día seis y el día siete, reemplace el medio por encima de las células con un mililitro de medio de diferenciación de células endoteliales homogéneas recién preparado por pocillo e incube las células durante otras 24 horas. El octavo día. Después de separar y lavar las células, divídalas uniformemente en tubos de microcentrífuga en hielo, cada uno con un mínimo de 600 microlitros de células a una densidad de 1 veces 10 a la 5ª célula por mililitro.
Agregue anticuerpos a los tubos que contienen células según corresponda e incubar en hielo protegido de la luz durante 30 minutos. Granular las células por centrifugación a 1000 veces G y 4 grados centígrados durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en 600 microlitros de tampón de clasificación helada.
Colar las muestras a través de la tapa del filtro de malla de cinco mililitros de tubos FACS y almacenar las células en hielo protegido de la luz para la clasificación inmediata de las células. Para aislar las células endoteliales hemogénicas mediante FACS, primero se debe bloquear la población de células CD45 negativas. Luego, dentro de la población CD45 negativa, compuerta las células CD31 positivas.
A continuación, dentro de la población CD31 positiva, la puerta para la población de células VE-cadherina negativa. Y luego, dentro de la población VE-cadherina negativa, puerta para las células c-Kit-positivas. De la población c-Kit-positiva, puerta la población de células CD34-positivas.
Y finalmente, de la población de células CD34 positivas, identificar y recolectar las células KDR positivas. Después de sembrar células endoteliales hemogénicas en un medio a base de metilcelulosa formulado para el crecimiento de células progenitoras hematopoyéticas, las colonias eritroides unitarias formadoras de colonias y las colonias eritroides unitarias formadoras de explosiones se cuentan el día ocho. Unidad formadora de colonias-granulocitos-macrófagos y unidad formadora de colonias-granulocito, eritroide, macrófago y megacariocitos.
Las colonias progenitoras hematopoyéticas multipotentes se cuentan el día 14. Por cada 1000 células endoteliales hemogénicas plateadas, se generan aproximadamente 20 unidades formadoras de colonias. Las células con morfología de células endoteliales también son visibles en los cultivos.
Estas son las células endoteliales hemogénicas que dan lugar a progenitores hematopoyéticos multilinaje a nivel unicelular. Este protocolo es un sistema de cultivo sin suero 2D y alimentador murino que puede generar células endoteliales hemogénicas humanas en aproximadamente una semana.
