Направленная дифференцировка гемогенных эндотелиальных клеток из плюрипотентных стволовых клеток человека

Этот протокол подробно описывает метод генерации хорошо охарактеризованной популяции гемогенных эндотелиальных клеток человека. Эти клетки могут быть использованы для изучения молекулярной регуляции и эндотелиального перехода к кроветворению. Начните с культивирования эмбриональных стволовых клеток человека в течение четырех дней, чтобы дифференцировать их в первичные эндотелиальные клетки.

На пятый день аспирируйте среду над клетками. Затем аккуратно промыть клетки одним миллилитром DMEM/F-12 на лунку. Добавьте один миллилитр свежеприготовленной гемогенной среды дифференцировки эндотелиальных клеток на лунку и инкубируйте клетки в течение 24 часов при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.

На шестой и седьмой день замените среду над клетками одним миллилитром свежеприготовленной гомогенной среды дифференцировки эндотелиальных клеток на лунку и инкубируйте клетки еще 24 часа. На восьмой день. после отсоединения и промывки клеток делят их равномерно на микроцентрифужные трубки на льду, каждая из которых содержит минимум 600 микролитров клеток при плотности от 1 раза 10 до 5-й ячейки на миллилитр.

Добавьте антитела в трубки, содержащие клетки по мере необходимости, и инкубируйте на льду, защищенном от света, в течение 30 минут. Гранулируйте ячейки центрифугированием при 1000 G и 4 градусах Цельсия в течение пяти минут. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулы в 600 микролитров ледяного сортировочного буфера.

Процедите образцы через крышку сетчатого фильтра из пяти миллилитровых трубок FACS и храните ячейки на льду, защищенном от света, для немедленной сортировки клеток. Чтобы изолировать гемогенные эндотелиальные клетки с помощью FACS, сначала защитите CD45-отрицательную клеточную популяцию. Затем в пределах CD45-отрицательной популяции затвор CD31-положительных клеток.

Следующий в CD31-положительной популяции, ворота для VE-кадгерин-отрицательной клеточной популяции. А затем в пределах VE-кадгерин-отрицательной популяции, ворота для c-Kit-положительных клеток. Из c-Kit-положительной популяции выйдите из CD34-положительной клеточной популяции.

И, наконец, из CD34-положительной клеточной популяции, идентифицируйте и собирайте KDR-положительные клетки. После посева гемогенных эндотелиальных клеток в среду на основе метилцеллюлозы, разработанную для роста гемопоэтических клеток-предшественников, колониеобразующих колоний unit-erythroid и бласт-образующих unit-erythroid колоний, подсчитывают на восьмой день. Колониеобразующая единица - гранулоцит-макрофаг и колониеобразующая единица - гранулоцит, эритроид, макрофаг и мегакариоцит.

Мультипотентные кроветворные колонии-прародители подсчитывают на 14 день. На 1000 покрытых гемогенных эндотелиальных клеток образуется около 20 колониеобразующих единиц. Клетки с морфологией эндотелиальных клеток также видны в культурах.

Это гемогенные эндотелиальные клетки, которые дают начало многолинейным кроветворным предшественникам на одноклеточном уровне. Этот протокол представляет собой 2D-систему культур без сыворотки и мышей, которая может генерировать гемогенные эндотелиальные клетки человека примерно за одну неделю.