인간 만능 줄기 세포로부터 혈구 내피 세포의 유도 분화

이 프로토콜은 인간 혈구 내피 세포의 잘 특성화된 집단을 생성하는 방법을 상세히 설명한다. 이들 세포는 분자 조절 및 내피에서 조혈로의 전이를 연구하는데 활용될 수 있다. 인간 배아 줄기 세포를 4 일 동안 배양하여 원시 내피 세포로 분화시키는 것으로 시작하십시오.

5 일째에 세포 위의 배지를 흡인하십시오. 그런 다음 웰당 DMEM/F-12 1밀리리터로 세포를 부드럽게 씻습니다. 웰당 새로 준비된 조혈 내피 세포 분화 배지 1밀리리터를 추가하고 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.

6일째 및 7일째에 세포 위의 배지를 웰당 새로 준비된 동성 내피 세포 분화 배지 1밀리리터로 교체하고 세포를 추가로 24시간 동안 배양합니다. 여덟 번째 날. 세포를 분리하고 세척 한 후 얼음 위의 미세 원심 분리 튜브로 골고루 나누고 각각 밀리리터 당 1 배 10에서 5 번째 세포의 밀도로 최소 600 마이크로 리터의 세포를 포함합니다.

세포를 포함하는 튜브에 항체를 적절하게 추가하고 빛으로부터 보호 된 얼음에서 30 분 동안 배양하십시오. 세포를 1000배 G 및 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿화한다. 상청액을 제거하고 600 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 분류 완충액에 펠릿을 재현탁시킨다.

5 밀리리터 FACS 튜브의 메쉬 필터 캡을 통해 샘플을 변형시키고 즉각적인 세포 분류를 위해 빛으로부터 보호 된 얼음에 세포를 보관하십시오. FACS로 혈구 내피 세포를 분리하려면 먼저 CD45 음성 세포 집단을 게이트하십시오. 그런 다음 CD45 음성 집단 내에서 CD31 양성 세포를 게이트합니다.

다음으로 CD31 양성 집단 내에서 VE- 카드 헤린 음성 세포 집단에 대한 게이트. 그런 다음 VE- 카드 헤린 음성 집단 내에서 c- 키트 양성 세포에 대한 게이트. c-Kit 양성 집단에서 CD34 양성 세포 집단을 게이트합니다.

마지막으로 CD34 양성 세포 집단에서 KDR 양성 세포를 식별하고 수집합니다. 조혈 전구 세포의 성장을 위해 제조된 메틸셀룰로오스 기반 배지에 혈구 내피 세포를 파종한 후, 콜로니 형성 단위-적혈구 콜로니 및 블라스트 형성 단위-적혈구 콜로니가 8일째에 계산됩니다. 집락 형성 단위-과립구-대 식세포 및 집락 형성 단위-과립구, 적혈구, 대 식세포 및 거대 세포.

다능성 조혈 전구 콜로니는 14일째에 계산됩니다. 1000개의 혈성 내피 세포가 도금될 때마다 약 20개의 콜로니 형성 단위가 생성됩니다. 내피 세포 형태를 가진 세포도 배양에서 볼 수 있습니다.

이들은 단일 세포 수준에서 다중 계통 조혈 전구 세포를 생성하는 혈구 내피 세포입니다. 이 프로토콜은 약 1주일 내에 인간 혈구 내피 세포를 생성할 수 있는 2D 혈청 및 쥐 피더가 없는 배양 시스템입니다.