Bu protokol, iyi karakterize edilmiş bir insan hemojenik endotel hücresi popülasyonu oluşturmak için bir yöntemi detaylandırır. Bu hücreler moleküler regülasyonu ve endotelyal-hematopoetik geçişi incelemek için kullanılabilir. İnsan embriyonik kök hücrelerini ilkel endotel hücrelerine ayırmak için dört gün boyunca kültürleyerek başlayın.
Beşinci günde, hücrelerin üzerindeki ortamı aspire edin. Daha sonra hücreleri kuyucuk başına bir mililitre DMEM / F-12 ile nazikçe yıkayın. Kuyu başına bir mililitre taze hazırlanmış hemojenik endotel hücre farklılaşma ortamı ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte 24 saat boyunca inkübe edin.
Altıncı gün ve yedinci günde, hücrelerin üzerindeki ortamı, kuyucuk başına bir mililitre taze hazırlanmış homojen endotel hücre farklılaşma ortamı ile değiştirin ve hücreleri 24 saat daha inkübe edin. Sekizinci günde. Hücreleri ayırdıktan ve yıkadıktan sonra, her biri mililitre başına 5. hücrelere 1 çarpı 10 ila 5. hücre yoğunluğunda en az 600 mikrolitre hücre içeren buz üzerindeki mikrosantrifüj tüplerine eşit olarak bölün.
Hücreleri içeren tüplere uygun şekilde antikorlar ekleyin ve 30 dakika boyunca ışıktan korunan buz üzerinde inkübe edin. Hücreleri beş dakika boyunca 1000 kez G ve 4 santigrat derecede santrifüjleme ile toplayın. Süpernatantı çıkarın ve peletleri 600 mikrolitre buz gibi soğuk ayıklama tamponunda yeniden askıya alın.
Numuneleri beş mililitrelik FACS tüplerinin ağ filtre kapağından süzün ve hücreleri anında hücre sıralamak için ışıktan korunan buz üzerinde saklayın. Hemojenik endotel hücrelerini FACS ile izole etmek için, önce CD45-negatif hücre popülasyonunu kapıya verin. Daha sonra CD45-negatif popülasyon içinde, CD31-pozitif hücreleri kapı.
Daha sonra CD31-pozitif popülasyon içinde, VE-kadherin-negatif hücre popülasyonu için kapı. Ve sonra VE-kadherin-negatif popülasyonda, c-Kit-pozitif hücreler için kapı. C-Kit-pozitif popülasyondan, CD34-pozitif hücre popülasyonunu kapılayın.
Ve son olarak, CD34-pozitif hücre popülasyonundan, KDR-pozitif hücreleri tanımlayın ve toplayın. Hematopoetik Progenitör Hücrelerin büyümesi için formüle edilmiş Metilselüloz bazlı bir ortamda hemojenik endotel hücreleri tohumlandıktan sonra, sekizinci günde Koloni Oluşturan Birim-Eritroid koloniler ve Patlama Oluşturan Birim-Eritroid koloniler sayılır. Koloni Oluşturan Birim-Granülosit-Makrofaj ve Koloni Oluşturan Birim-Granülosit, Eritroid, Makrofaj ve Megakaryosit.
Multipotent hematopoetik progenitör koloniler 14. günde sayılır. Kaplanan 1000 hemojenik endotel hücresi başına yaklaşık 20 koloni oluşturan birim üretilir. Endotel hücre morfolojisine sahip hücreler kültürlerde de görülebilir.
Bunlar, tek hücre düzeyinde multilineage hematopoetik progenitörlere yol açan hemojenik endotel hücreleridir. Bu protokol, yaklaşık bir hafta içinde insan hemojenik endotel hücreleri üretebilen 2D serum ve murin besleyici içermeyen bir kültür sistemidir.
