التمايز الموجه للخلايا البطانية الدموية من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

يفصل هذا البروتوكول طريقة لتوليد مجموعة مميزة جيدا من الخلايا البطانية البشرية المولدة للدم. يمكن استخدام هذه الخلايا لدراسة التنظيم الجزيئي والانتقال من البطانة إلى المكونة للدم. ابدأ بزراعة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لمدة أربعة أيام لتمييزها إلى خلايا بطانية بدائية.

في اليوم الخامس ، استنشاق الوسط فوق الخلايا. ثم اغسل الخلايا برفق باستخدام ملليلتر واحد من DMEM / F-12 لكل بئر. أضف ملليلتر واحد من وسط تمايز الخلايا البطانية الدموية الطازج لكل بئر واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في اليوم السادس واليوم السابع ، استبدل الوسط فوق الخلايا بملليلتر واحد من وسط تمايز الخلايا البطانية المتجانسة المعد حديثا لكل بئر ، واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى. في اليوم الثامن. بعد فصل الخلايا وغسلها ، قسمها بالتساوي إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة على الجليد ، يحتوي كل منها على ما لا يقل عن 600 ميكرولتر من الخلايا بكثافة 1 مرة 10 إلى 5 خلايا لكل ملليلتر.

أضف الأجسام المضادة إلى الأنابيب التي تحتوي على خلايا حسب الاقتضاء واحتضانها على ثلج محمي من الضوء لمدة 30 دقيقة. قم بتكوير الخلايا بالطرد المركزي عند 1000 مرة G و 4 درجات مئوية لمدة خمس دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الكريات في 600 ميكرولتر من مخزن الفرز البارد المثلج.

قم بتصفية العينات من خلال غطاء المرشح الشبكي لأنابيب FACS سعة خمسة ملليلتر وقم بتخزين الخلايا على الجليد المحمي من الضوء لفرز الخلايا على الفور. لعزل الخلايا البطانية الدموية بواسطة FACS ، قم أولا ببوابة مجموعة الخلايا السلبية CD45. ثم داخل المجتمع الإحصائي السلبي CD45 ، قم ببوابة الخلايا الإيجابية CD31.

التالي ضمن السكان الإيجابيين CD31 ، بوابة لمجتمع الخلايا السلبية VE-cadherin. ثم داخل السكان سلبي VE-cadherin ، بوابة للخلايا الإيجابية c-Kit. من السكان الإيجابيين c-Kit ، قم ببوابة مجتمع الخلايا الإيجابي CD34.

وأخيرا من مجتمع الخلايا الإيجابية CD34 ، حدد الخلايا الإيجابية KDR واجمعها. بعد بذر الخلايا البطانية الدموية في وسط قائم على ميثيل سلولوز تمت صياغته لنمو الخلايا السلفية المكونة للدم ، يتم حساب مستعمرات تشكيل وحدة الإريثرويد ، ومستعمرات تشكيل الانفجار - مستعمرات الإريثرويد في اليوم الثامن. وحدة تشكيل المستعمرة - الخلايا المحببة - البلاعم ووحدة تشكيل المستعمرات - المحببة ، الكريات الحمراء ، الضامة ، والخلايا الضخمة.

يتم حساب مستعمرات السلف المكونة للدم متعددة القدرات في اليوم 14. لكل 1000 خلية بطانية دموية مطلية ، يتم إنشاء ما يقرب من 20 وحدة تشكيل مستعمرة. الخلايا ذات مورفولوجيا الخلايا البطانية مرئية أيضا في الثقافات.

هذه هي الخلايا البطانية الدموية التي تؤدي إلى أسلاف المكونة للدم متعددة السلالات على مستوى خلية واحدة. هذا البروتوكول عبارة عن مصل 2D ونظام ثقافة خال من تغذية الفئران يمكنه توليد خلايا بطانية بشرية في أسبوع واحد تقريبا.