Différenciation dirigée de cellules endothéliales hémogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Ce protocole détaille une méthode pour générer une population bien caractérisée de cellules endothéliales hémogènes humaines. Ces cellules peuvent être utilisées pour étudier la régulation moléculaire et la transition endothéliale-hématopoïétique. Commencez par cultiver des cellules souches embryonnaires humaines pendant quatre jours pour les différencier en cellules endothéliales primordiales.

Le cinquième jour, aspirez le milieu au-dessus des cellules. Ensuite, lavez doucement les cellules avec un millilitre de DMEM / F-12 par puits. Ajouter un millilitre de milieu de différenciation des cellules endothéliales hémogènes fraîchement préparé par puits et incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.

Le sixième et le septième jour, remplacez le milieu au-dessus des cellules par un millilitre de milieu de différenciation des cellules endothéliales homogènes fraîchement préparé par puits, et incuber les cellules pendant 24 heures supplémentaires. Le huitième jour. Après avoir détaché et lavé les cellules, divisez-les uniformément en tubes de microcentrifugeuses sur de la glace, chacun contenant un minimum de 600 microlitres de cellules à une densité de 1 fois 10 à la 5ème cellule par millilitre.

Ajouter des anticorps aux tubes contenant les cellules, le cas échéant, et incuber sur de la glace à l’abri de la lumière pendant 30 minutes. Enduire les cellules par centrifugation à 1000 fois G et 4 degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez les granulés en suspension dans 600 microlitres de tampon de tri glacé.

Filtrer les échantillons à travers le capuchon filtrant des tubes FACS de cinq millilitres et stocker les cellules sur de la glace à l’abri de la lumière pour un tri cellulaire immédiat. Pour isoler les cellules endothéliales hémogènes par FACS, commencez par la population de cellules CD45 négatives. Ensuite, au sein de la population CD45-négative, porte les cellules CD31-positives.

Suivant dans la population CD31-positive, porte pour la population de cellules VE-cadhérine-négative. Et puis au sein de la population VE-cadhérine-négative, porte pour les cellules c-Kit-positives. De la population c-Kit-positive, porte la population de cellules CD34-positives.

Et enfin, à partir de la population de cellules CD34-positives, identifier et collecter les cellules KDR-positives. Après l’ensemencement des cellules endothéliales hémogènes dans un milieu à base de méthylcellulose formulé pour la croissance des cellules progénitrices hématopoïétiques, les colonies d’unités érythroïdes formant des colonies et les colonies d’unités érythroïdes formant des explosions sont comptées au huitième jour. Unité formant colonie-granulocytes-macrophages et unité formant colonie-granulocytes, érythroïdes, macrophages et mégacaryocytes.

Les colonies progénitrices hématopoïétiques multipotentes sont comptées au jour 14. Pour 1000 cellules endothéliales hémogènes plaquées, environ 20 unités formant colonie sont générées. Les cellules ayant une morphologie de cellules endothéliales sont également visibles dans les cultures.

Ce sont les cellules endothéliales hémogènes qui donnent naissance à des progéniteurs hématopoïétiques multilignés au niveau unicellulaire. Ce protocole est un système de culture 2D sans sérum et sans alimentation murine qui peut générer des cellules endothéliales hémogènes humaines en une semaine environ.