Este protocolo puede ayudar a los científicos que están interesados en estudiar la función molecular de los astrocitos humanos en su nicho nativo. La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento y enriquecimiento de un tipo celular específico, astrocitos adultos a partir de muestras de tejido cerebral humano a granel utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia. Esta metodología se puede aplicar para aislar otros tipos de células de la neocorteza humana, como las neuronas y las células progenitoras de oligodendrocitos utilizando otros anticuerpos conjugados fluorescentes apropiados.
Comience a diseccionar aproximadamente de 200 a 400 miligramos de tejido de una muestra fresca de tejido de corteza adulta humana congelada. Coloque el tejido en un douncer de tejido de vidrio de siete mililitros que contenga cuatro mililitros de tampón de lisis helado sobre hielo y moler el tejido aproximadamente 50 veces. Transfiera el homogeneizado a un tubo de polipropileno ultracentrífuga de 12 mililitros.
Use una pipeta de cinco mililitros para agregar 6,5 mililitros de tampón de sacarosa helada al fondo del tubo de la ultracentrífuga sin perturbar la interfaz entre la sacarosa y el homogeneizado del tejido. Para recoger los núcleos, ultracentrifugar el lisado durante una hora a 101, 814 veces G y aspirar cuidadosamente el sobrenadante y los escombros sin perturbar el pellet. Agregue 0.1% BSA en PBS al tubo de la ultracentrífuga durante una incubación de 10 minutos en hielo antes de volver a depositar el pellet de núcleos.
Luego, use azul tripano para visualizar los núcleos intactos bajo un microscopio de luz y para asegurarse de que la concentración sea superior a 10 a los quintos núcleos por mililitro Para la clasificación activada por fluorescencia de los núcleos aislados, agregue aproximadamente 20 microlitros de la muestra resuspendida a una solución de anticuerpos que contenga el anticuerpo anti-NeuN conjugado de ratón Alexa fluor 555. Agregue aproximadamente 20 microlitros de la muestra resuspendida a una solución de anticuerpos que contenga anticuerpos anti-PAX6 de ratón conjugados con APC. Después de una incubación de una hora a cuatro grados centígrados con agitación, protegido de la luz, agregue DAPI en una proporción de 1: 1000 a todas las muestras y controles.
Para incluir núcleos del tamaño apropiado y para excluir los glóbulos rojos y los desechos, use un tubo de control para cerrar las células por sus áreas de dispersión hacia adelante y hacia los lados. Para seleccionar la población de núcleos singletes, puerta por área de dispersión hacia adelante versus ancho o alto de dispersión hacia adelante y área de dispersión lateral versus ancho o alto de dispersión lateral. Puerta por DAPI para incluir solo los singletes de núcleos intactos y para excluir cualquier escombro y doblete.
Después de cerrar de acuerdo con cualquier control de fluorescencia adicional, ejecute la muestra de control solo DAPI. Ejecute el control NeuN Alexa fluor 555-only para determinar el corte para la tinción NeuN-positiva en el canal Alexa fluor 555. Ejecute el control pax6 apc-only para determinar el corte de la tinción PAX6-positiva en el canal APC.
Después de que se hayan ejecutado todos los controles, cierre las células NeuN-positivas para recolectar las neuronas y puerta las células PAX6-positivas con la población NeuN-negativa para recolectar los astrocitos. Gate y recolecte cualquier población glial adicional de interés de la población PAX6 negativa NeuN negativa. Para la secuenciación de ARN de un solo núcleo a granel, después de recolectar de 50, 000 a 500, 000 núcleos en PBS suplementado con BSA al 0.04%, agregue dos mililitros de solución de sacarosa, 50 microlitros de cloruro de calcio molar y 30 microlitros de acetato de magnesio monolar a la muestra.
Lleve el volumen final de la suspensión hasta 10 mililitros con PBS. Mezclar el contenido del tubo por inversión e incubar la reacción en hielo durante 15 minutos. Granular los núcleos por centrifugación y resuspendir los núcleos en un mililitro de reactivo de extracción de ARN.
Luego, vórtice el tubo, congele la muestra en hielo seco y almacene los núcleos a menos 80 grados centígrados. Para la secuenciación de cromatina aceptable para la transposasa de un solo núcleo a granel, recolecte de 50, 000 a 75, 000 núcleos en PBS suplementado con BSA al 0.04% en un tubo de microcentrífuga recubierto con 5% de BSA y congele los núcleos hasta su análisis aguas abajo. Las poblaciones de núcleos progenitores neuronales, de astrocitos y oligodendrocitos se pueden clasificar a partir de una muestra fresca de neocórtex temporal humano postmortem congelado, como se ha demostrado.
Los estudios de secuenciación de ARN de un solo núcleo priorizaron aún más PAX6 como un factor de transcripción nuclear expresado diferencialmente en las subpoblaciones de astrocitos adultos protoplásmicos y fibrosos. Después de la clasificación, se pueden caracterizar alteraciones del transcriptoma específico del tipo celular en el neocórtex de epilepsia patológica primaria. En este análisis, los análisis transcriptómicos confirmaron que las poblaciones PAX6 positivas neun-negativas se enriquecieron robustamente para los marcadores de panastrocitos y se agotaron para los marcadores neuronales.
La tinción por inmunofluorescencia se puede utilizar para confirmar la colocalización de PAX6 con proteína ácida fibrilar glial en astrocitos corticales humanos. Los intervalos postmortem más cortos se asocian con una mayor recuperación de núcleos intactos a partir de muestras de tejido fresco. Un alto rendimiento de núcleos intactos se puede recuperar del tejido congelado hasta 24 horas después de la autopsia, pero a las 30 horas, se pueden recuperar muy pocos núcleos intactos.
Lo más importante a recordar es obtener la población PAX6 positiva de la población NeuN negativa, porque hay neuronas que también expresan PAX6, y queremos excluirlas. Esta técnica también permitió el estudio de astrocitos en muestras cerebrales quirúrgicas de epilepsia, dilucidando aún más la desregulación molecular de los astrocitos humanos en el contexto de un nicho patológico específico.
