Los astrocitos son una población autógena interesante para la programación neuronal directa. Este protocolo proporciona una técnica confiable para aislar astrocitos de cultivo con alta pureza de diferentes regiones o del sistema nervioso central. Este protocolo está diseñado y optimizado para investigar la capacidad de los astrocitos para ser reprogramados en neuronas funcionales sin factores de confusión como las diferencias en la pureza de los astrocitos de diferentes poblaciones iniciales.
La demostración del procedimiento será realizada por Bob Hersbach, Postdoc en el laboratorio, y Tatiana Simon, una asistencia técnica en nuestro laboratorio. Para empezar, coloca el torso de un ratón sacrificado en una placa de Petri de 35 milímetros y mantenlo en hielo. Abra la piel con tijeras y retire la vértebra con tijeras pequeñas.
Luego extraiga la médula espinal y colóquela en un tampón de disección sobre hielo. Bajo un microscopio de disección estereotáctica con dos aumentos de aumento, retire las meninges de la médula espinal aislada con fórceps y transfiera el tejido de la médula espinal diseccionado y limpiado a un tubo C. Agregue 50 microlitros de enzima P del kit de disociación de tejido neural y 30 microlitros de mezcla enzimática previamente preparada a cada tubo C.
Invierta los tubos C y colóquelos en un calentado disociado asegurándose de que todo el tejido se recoja en la tapa del tubo. Eludir las células retirando la columna del separador agregando 800 microlitros de medio de cultivo de astrocitos y empujando las células fuera de la columna con el émbolo incluido. Células en placa en los matraces de cultivo previamente preparados mediante la adición de 4,2 mililitros de medio de cultivo de astrocitos suplementado con 10 nanogramos por mililitros de EGF y bFGF.
No es necesario recubrir los matraces de cultivo para los astrocitos aislados de otras regiones del cerebro, pero proporciona un mejor sustrato para los astrocitos aislados de la médula espinal. Cultive las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Realice asientos de astrocitos debajo de un gabinete de seguridad biológica con un nivel de seguridad uno y prepare 24 placas de pocillos con hojas de cubierta de vidrio recubiertas de poli-D-lisina como se describe en el manuscrito de texto.
Para el recubrimiento, aislar seis médulas espinales de ratones P2 produce alrededor de 1 millón de células. Aspirar los medios de cultivo de los matraces de cultivo T-12.5 que contienen los astrocitos cultivados y lavar una vez con 1x PBS. Separar los astrocitos del matraz de cultivo añadiendo 0,5 mililitros de 0,05% de tripsina EDTA e incubar a 37 grados centígrados durante cinco minutos.
Golpee suavemente el costado del matraz para liberar las células de la superficie del matraz de cultivo y compruebe el desprendimiento bajo un microscopio de campo claro con un aumento de 10 veces. Detener la tripsinazación con 2,5 mililitros de medio de cultivo de astrocitos y recoger la suspensión celular en tubos de 15 mililitros. Centrifugar a 300 RCF durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.
Aspirar sobrenadante y reenviar células en un mililitro de medio de cultivo de astrocitos. Calcule la concentración celular utilizando un hemocitómetro o un sistema automatizado de conteo celular. Según el número de células, diluir la suspensión celular con medio de astrocito fresco suplementado con EGF y bFGF a 10 nanogramos por mililitro por factor.
Agregue 500 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de las placas de 24 pocillos previamente preparadas y células de cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Prepare el medio de diferenciación neuronal agregando un suplemento de mililitro B27 a 49 mililitros de medio de cultivo básico. Después de 24 a 48 horas, dependiendo de si las células han sido transducidas o transfectadas, reemplace el medio de astrocito con un medio de diferenciación neuronal de mililitro por pocillo.
Cultive las células a 37 grados centígrados con 9% de dióxido de carbono. Para aumentar la eficiencia de reprogramación, complemente el medio de diferenciación neuronal con forskoline y dorsomorfina a una concentración final de 30 micromolares y un micromolar respectivamente al reemplazar el medio astrocitario con el medio de diferenciación. Cuando opte por tratar las células con forskoline y dorsomorphin proporcionar una segunda dosis de dorsomorfina dos días después del tratamiento inicial.
Añadir este segundo tratamiento directamente al medio de cultivo. Los cultivos primarios de astrocitos alcanzaron una confluencia del 80 al 90% entre siete y 10 días después de la clasificación y el recubrimiento celular asistido por magnética. El día después del recubrimiento, las células generalmente cubrían del 50 al 60% de la superficie de deslizamiento de la cubierta.
Los cultivos consistían principalmente en astrocitos en esta etapa, mientras que otros tipos de células como los neuroblastos estaban prácticamente ausentes. A los siete días después de la transducción o transfección, las células neuronales inducidas se distinguían claramente de los astrocitos. El soma de células neuronales era más pequeño que el no reprogramado Los astrocitos tenían procesos largos y eran positivos para el marcador neuronal, beta tres tubulina y negativo para el marcador de astrocitos GFAP.
A los 21 días después de la transducción o transfección, muchas neuronas inducidas fueron capaces de disparar potenciales de acción y fueron positivas para el marcador neuronal maduro NeuN y la proteína pansináptica Sinaptofisina. Es esencial diseccionar adecuadamente la región de interés. Evitar la contaminación del tejido circundante.
Se debe tener cuidado para eliminar las meninges y los ganglios de la raíz dorsal de la médula espinal aislada. Este método se puede utilizar para aislar astrocitos de varias regiones del sistema nervioso central, incluyendo la corteza cerebral, el mesencéfalo dorsal y el cerebelo. En el futuro, esta técnica nos permitirá ampliar nuestro conocimiento sobre los astrocitos regionales y su potencial para ser reprogramados en neuronas funcionales.
