Hasta la fecha, CRISPR solo se ha utilizado en un puñado de hemípteros. El protocolo descrito aquí podría ayudar a los investigadores a aplicar CRISPR y la transformación de la línea germinal en otras especies de hemípteros. Este protocolo fue desarrollado específicamente para embriones de insectos que son sensibles a la desecación.
Muchos pasos en el protocolo podrían mejorar los resultados en otras especies de insectos. La capacidad de generar saltamontes transgénicos abre la puerta a nuevos métodos de control, como la creación de insectos que ya no pueden transmitir virus. Esta técnica será revolucionaria para estudiar la función génica en otras plagas, como los trips de las flores occidentales.
Hemos adaptado esta técnica CRISPR para embriones de trips con resultados prometedores. Encontramos que la práctica en este sistema es esencial para el éxito. Los métodos que se muestran aquí, cuando se realizan de forma rutinaria, deben permitir un uso flexible en una variedad de entornos.
Para hacer una cámara para sostener a los insectos adultos Peregrinus maidis, haga un agujero en el fondo de una taza de una onza y pegue una pantalla sobre el agujero para el intercambio de aire. Para la selección de insectos hembra adultos de una semana de edad, aspire la colonia en un tubo cónico de 15 mililitros durante una hora, antes de enfriar brevemente los insectos en hielo. Identifique a las hembras por la presencia del ovipositor, que es típicamente más oscuro que el resto del abdomen, en el lado ventral del abdomen.
Transfiera las hembras a la copa a medida que se recogen. Cuando se hayan seleccionado 15 hembras, selle la taza con una película de cera de parafina de cinco por cinco centímetros. Aplique 400 microlitros de una solución de sacarosa al 10% en la parte superior de la película y coloque una segunda pieza de película de cinco por cinco centímetros sobre la solución.
Coloque la cámara para adultos en un plato de recolección de huevos con el lado de la película de cera de parafina de plástico en contacto directo con el medio de oviposición, y envuelva toda la cámara de puesta de huevos con una envoltura de plástico sin cubrir los orificios de aire. Luego, coloque la cámara a 25 grados centígrados con 70% de humedad y 14 horas de luz, ciclo oscuro de 10 horas. Para la recolección de embriones, después del período de puesta de huevos deseado, aplique una tira de uno por 15 milímetros de cinta adhesiva de doble cara sobre un cubreobjetos de 22 por 30 milímetros y coloque el cubreobjetos en el medio de oviposición de la cámara de puesta de huevos.
Usando un cepillo fino y un microscopio de disección, mueva embriones semitransparentes individuales de la superficie del agar a la cinta de doble cara. Cuando se hayan seleccionado unos 25 embriones, coloque los embriones en forma de plátano en sus lados con los extremos más grandes pegados en la cinta. Para la microinyección de los embriones, primero, coloque el deslizamiento de la cubierta en una placa de Petri de 100 por 15 mililitros al ras con agar al 1% bajo un microscopio de disección dentro de una campana humidificada.
Para verificar la presión de inyección, coloque la punta de una aguja de inyección de cuarzo en una gota de agua e inicie el ciclo de inyección. Después de confirmar el ajuste de presión, acercándose desde el lado izquierdo del cubreobjetos, inserte la aguja en el extremo más grande de un embrión. Administre la solución inyectable en el huevo y saque rápidamente la aguja.
Cuando se hayan inyectado todos los huevos, coloque el deslizamiento de la cubierta sobre la superficie de un nuevo plato de agar al 1% y coloque el plato en una cámara de humedad. Después de seis días, use agua limpia y cepillo fino para transferir cualquier embrión sobreviviente a una placa de Petri de 35 por 10 milímetros que contenga papel de filtro humedecido con agua. Selle la placa de Petri con una película de cera de parafina de plástico y coloque la cámara de eclosión en una incubadora de 25 grados centígrados.
Después de seis a ocho días, use un cepillo fino para transferir cualquier ninfa emergente del primer estadio a una placa de Petri de recortes de hojas y selle el plato con una película de cera de parafina de plástico. Después de 48 horas a 25 grados centígrados, use un cepillo fino para transferir a todas las ninfas de dos días de edad a una jaula de cría con plantas de maíz. Si los inyectados con fenotipo visible se recuperan en cantidades suficientes, enjaular estos insectos por separado para maximizar la recuperación del rasgo objetivo en la próxima generación.
Criar a los insectos bajo las condiciones apropiadas de temperatura y humedad con transferencias regulares a plantas de maíz fresco según sea necesario, y examinar a la progenie regularmente para detectar fenotipos esperados, colocando a los individuos que exhiben el fenotipo deseado en sus propias jaulas para establecer líneas homocigóticas. En este análisis representativo, se recolectaron un total de 6, 483 huevos de un total de 645 hembras en cuatro semanas. Las hembras generalmente comienzan a poner huevos después de dos días y proporcionan la mayoría de los huevos desde el día cuatro hasta el seis, con la actividad de oviposición disminuyendo en el día nueve.
La inyección de Cas9 nueve no afecta el desarrollo de P. maidis, ya que las tasas de desarrollo para embriones tratados con tampón de inyección, tampón de inyección suplementado con Cas9 y tampón de inyección suplementado con Cas9 y tres ARN guía son similares. Las velocidades de sombreado para el búfer y los controles Cas9 también son similares. Sin embargo, las tasas de eclosión de los individuos que reciben la mezcla de tres guías suelen ser relativamente más bajas.
En este experimento representativo, de los 71 individuos inyectados en guía que se desarrollaron, 23 mostraron algún grado de pérdida de pigmento y nueve eclosionaron, lo que resultó en una tasa de nocaut de aproximadamente el 30%. Se espera que la mezcla de tres guías elimine aproximadamente 180 pares de bases del locus blanco, como se observa en los productos de PCR amplificados a partir de ADN genómico aislado de individuos inyectados. así como en los datos de secuencia asociados generados a partir de esos productos. Recomendamos el uso de agujas biseladas para minimizar el trauma de la inyección. Si los embriones parecen tener fugas después de la inyección, examine las puntas de las agujas para obtener mejores resultados.
La práctica continua aumentará la supervivencia del embrión. Hasta la fecha, no hay publicaciones que describan la transformación de la línea germinal en los hemípteros. Sin embargo, hemos utilizado este protocolo para hacer saltamontes que expresan Cas9.
En general, la capacidad de realizar la transformación de la línea germinal en los hemípteros abre la puerta a una amplia gama de estrategias genéticas de manejo de plagas, reduciendo así el uso de insecticidas.
