To y TD fueron apoyados por los números de subvención JSPS KAKENHI 19H02970 y 20H02999, respectivamente.

1. Mantenimiento de colonias de laboratorio
<ol><li>Para el mantenimiento de poblaciones de wildtype y mutantes, utilice un recipiente de plástico grande (460 mm x 360 mm x 170 mm) con alimentos artificiales regulares para peces, agua en vasos de plástico con un orificio de ventilación en la parte superior, un papel doblado para ocultar los insectos y algodón en capas para poner huevos(Figura 2A). Mantenga todos los cultivos de T. domestica dentro de incubadoras de 37 °C y establezca la humedad relativa (RH) dentro de cada recipiente en 60%-80%. NOTA: Debido a que T. domestica absorbe vapor de agua de la atmósfera11,no se necesita un suministro directo de agua. El RH adecuado se mantiene debido a la presencia de vapor de agua de vasos de plástico que contienen un orificio de ventilación en la parte superior o de tazas sin tapa dentro de cada recipiente. No hay necesidad de humidificar dentro de toda una incubadora que contiene cultivos. La duración aproximada de cada etapa de desarrollo bajo la condición descrita en este protocolo se muestra en la Figura 1. La velocidad de desarrollo podría ajustarse cambiando la temperatura y/o rh12.</li>
	<li>Agregue los alimentos periódicamente. Agregue agua antes de que se seque.</li>
	<li>Transfiera las poblaciones a un nuevo recipiente limpio al menos cada 3 meses, dado que los adultos dejan de poner huevos en un ambiente sucio y/o población densa (ver Discusión).</li>
</ol>2. Recolección de huevos y microinjección
<ol><li>Diseñar un ARN guía (gRNA)<ol>
<li>Diseñe una secuencia de gRNA para cada objetivo necesario y BLAST las secuencias de gRNA en el ensamblaje del genoma para comprobar posibles sitios de reconocimiento fuera de destino.</li>
		<li>Sintetizar y purificar los gRNAs de acuerdo con las instrucciones del fabricante8. NOTA: Como ejemplo, en el caso de dirigirse al gen blanco transportador de casete de unión a ATP, se diseñó una secuencia objetivo de 20 bp y se ordenaron dos oligonucleótidos de ADN sintetizados 5'-TAATACACTCACTATAGTAAGTGTTGGTGGGAC-3' y 5'-TTCTAGCTCTAAAACATCCCCCAACACTTA-3'. La plantilla de ADN se preparó recocido estos dos oligonucleótidos seguidos de amplificación de PCR y el gRNA se transcribe in vitro de la plantilla con una polimerasa de ARN T7.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparan colonias de recolección de huevo<ol>
<li>Transfiera alrededor de 20 adultos machos y 20 hembras a un recipiente de tamaño mediano (200 mm x 150 mm x 90 mm) con alimentos, suministro de agua, un papel doblado y un pequeño trozo de algodón en capas para la puesta de huevos(Figura 2B).</li>
		<li>Establecer varias colonias para obtener un gran número de embriones escenificados en un corto período de tiempo para ser utilizados para la edición del genoma. NOTA: Se espera que se recojan entre 20 y 40 huevos de una colonia después de 8 h a 37 °C. Por lo general, los adultos transferidos tardan unos días en empezar a poner huevos, posiblemente debido a la adaptación a un nuevo entorno.</li>
	</ol></li>
	<li>El día de la inyección, reemplace el algodón dentro de los recipientes por otros nuevos.</li>
	<li>Coloque una cinta de doble cara de 76 mm x 5 mm en una tobogán de vidrio normal de 76 mm x 26 mm.</li>
	<li>Ocho horas más tarde, recoge los huevos del algodón en capas separando las capas usando fórceps.</li>
	<li>Alinee los huevos en la cinta de doble cara con un pincel húmedo y mantenga una distancia de 2 mm entre los huevos. Todos los huevos deben estar orientados para que el eje longitudinal de un huevo se enfrente al lado de la inyección(Figura 3A). Presione suavemente los huevos con un pincel para sujetar firmemente durante la inyección. NOTA: En este protocolo, el hongo crece rápidamente en huevos inyectados dañados en condiciones húmedas y cálidas. Es importante mantener la distancia entre los huevos para evitar la contaminación cruzada y la expansión del hongo.</li>
	<li>Mezcle la proteína gRNA y Cas9 a una concentración final de 100 ng/μL y 500 ng/μL, respectivamente. Utilice agua destilada para diluirla. Incubar la mezcla durante 10 minutos a temperatura ambiente para promover la formación compleja ribonucleoprotein y luego mantener la mezcla en hielo. NOTA: Rojo neutro a una concentración final del 1% podría añadirse a la solución de inyección para controlar la cantidad inyectada.</li>
	<li>Cargue 2 μL de la solución gRNA/Cas9 en un capilar de inyección de vidrio con un microcargador. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la solución antes de la inyección. Si es necesario, toque la aguja para extraer las burbujas. NOTA: En este experimento, se utiliza una aguja prefabricada para obtener una punta de aguja fina (Figura 3B). En su lugar, se podría utilizar una aguja casera con una forma similar.</li>
	<li>Fijar el capilar de inyección de vidrio, previamente cargado con la solución gRNA/Cas9, a un soporte equipado con un manipulador y conectar el soporte a un microinyector electrónico.</li>
	<li>Optimice la forma de la punta de la aguja rompiéndolo ligeramente con fórceps para evitar obstrucciones y obteniendo una mejor durabilidad a lo largo de una serie de inyecciones (se muestra un ejemplo de una aguja adecuada en la Figura 3C). NOTA: Se recomienda cambiar una aguja cuando está obstruida. Es posible seguir inyectando con la misma aguja si se rompe de nuevo con fórceps, pero una punta más ancha conduce a más daño del huevo y reduce su tasa de supervivencia. Como los huevos T. domestica son blandos y frágiles, mantener una punta fina de aguja es clave para tener una alta tasa de supervivencia después de la inyección.</li>
	<li>Inserte la aguja en el punto medio del eje longitudinal de un huevo e inyecte una ligera cantidad de la solución (consulte la Figura 3D-H como referencia sobre la cantidad de inyección). Ajuste la configuración del microinyector electrónico durante la inyección, dependiendo de la forma de la punta de la aguja. NOTA: Se recomienda aplicar una presión constante durante la inyección, de lo contrario el contenido pegajoso del huevo puede fluir fácilmente en la aguja de vidrio y puede obstruirla. La solución puede ser inyectar un pulso de presión corto o con una presión constante, dependiendo de la cantidad de líquido inyectado. Tenga en cuenta que cuando una punta de aguja tiene una abertura amplia, se inyecta demasiada solución en un óvulo, lo que causa letalidad(Figura 3F-H). En ese caso, mantenga un flujo de líquido constante por presión constante, luego inserte la aguja en un huevo y extraiga inmediatamente. Si causa demasiado desbordamiento o el huevo estalla, cambie la aguja.</li>
	<li>Mantenga los huevos inyectados en un recipiente con el tamaño adecuado para el número de huevos inyectados (<20 huevos: plato pequeño; >20 huevos: recipiente de tamaño mediano) con 60%-80% RH y 37 °C.</li>
</ol>3. Apareamiento
<ol><li>Revise los huevos inyectados periódicamente y deseche los huevos dañados con fórceps para evitar el crecimiento fúngico(Figura 3I,J). En caso de que haya demasiado hongo creciendo en un huevo, limpie la superficie del huevo con un 70% de EtOH.</li>
	<li>Antes de eclosionar (aproximadamente 10 días a 37 °C después de la puesta de huevos), sumerja el vaso con los huevos inyectados en polvo de talco para cubrir la superficie de la cinta de doble cara. Esto evitará el apilamiento de ninfas eclosionadas. Transfiera los toboganes de vidrio recubiertos de polvo a un recipiente de tamaño mediano con alimentos, agua y un papel doblado para ocultar los insectos.</li>
	<li>Retire las diapositivas de vidrio después de que las ninfas hayan eclosionado. Suministran alimentos periódicamente hasta que lleguen a la edad adulta. NOTA: Se tarda aproximadamente 2.0–2.5 meses para que las personas lleguen a la edad adulta después de eclosionar(Figura 1A). La etapa adulta se juzga sobre la base de un ovipositor bien desarrollado en las hembras(Figura 1B).</li>
	<li>Para aparear a los individuos, transfiera tantos como sea necesario a adultos hembras de wildtype de una colonia de laboratorio al contenedor mediano e incubarlos durante al menos 14 días a 37 °C para asegurarse de que son vírgenes. NOTA: No es necesario recoger hembras vírgenes de una colonia de laboratorio porque las T. domestica adultas tienen un ciclo repetido de fundido y apareamiento llamado "ciclo reproductivo y ardiente", durante el cual las hembras tiran espermatozoides con cada muda y se aparean de nuevo en el siguiente ciclo de fertilización13.</li>
	<li>Transfiera un adulto G0 macho o hembra que se desarrolló de un huevo inyectado y un(los) adulto(s) de wildtype a un pequeño plato de plástico (Ø 100 mm x 40 mm) con alimentos, un papel doblado y un pequeño trozo de algodón para poner huevos G1(Figura 2C';plato de apareamiento). Mantenga los platos de apareamiento en un recipiente más grande con 60%-80% RH(Figura 2C). NOTA: Múltiples adultos de wildtype pueden ser incluidos en un plato para aumentar la probabilidad de apareamiento exitoso, aunque se han logrado altas tasas de éxito con emparejamiento uno a uno.</li>
</ol>4. Genotipado
<ol><li>Diseñe pares de imprimación PCR para cada gRNA para amplificar un producto de 100-200 bp que incluye el sitio dirigido por el gRNA. BLAST cada primera secuencia contra el ensamblaje del genoma para comprobar su especificidad (se muestra un ejemplo para la focalización del gen blanco en la Figura 4A).</li>
	<li>Compruebe la transformación germinina de los adultos G0.<ol>
<li>Cinco días después de que se ponen los huevos, recoger huevos G1 individuales de cada par adulto G0 en tubos de 0,2 ml (un huevo por tubo; almacenar muestras recogidas a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo). Separe las capas de algodón para recoger los huevos. NOTA: Se recomienda genotipo de al menos 12 ninfas G1 de cada par de acoplamiento para evaluar el éxito de la transmisión de la línea germinográfica (ver Resultados representativos).</li>
		<li>Añadir 15 μL de una solución Proteinasa K de 0,25 mg/ml (disuelta en tampón Tris-EDTA) a cada tubo, homogeneizar brevemente muestras con palillos de dientes e incubar a 55 °C durante 3 a 16 h.</li>
		<li>Inactive la Proteinasa K colocando las muestras a 95 °C durante 10 min.</li>
		<li>Añadir 90 μL de agua destilada a cada tubo y mezclar bien. Utilice 2 μL de sobrenadante en una mezcla de reacción PCR de 10 μL que contenga las imprimaciones diseñadas en el paso 4.1. NOTA: Se recomienda el uso de una polimerasa de ADN optimizada para plantillas crudas para alcanzar suficiente amplificación de PCR.</li>
		<li>Para analizar los productos PCR, realice un ensayo de movilidad heteroduplex (HMA) con un sistema de electroforesis de microchip(Figura 3B;ver Ohde et al., 2018)8. NOTA: Las mutaciones podrían evaluarse con dos métodos alternativos: (1) HMA con polímeros de gel estándar, como 8% poliacrilamida14; (2) digestión de productos DEP con endonuclease T7 seguido de electroforesis de gel de agarose15.</li>
		<li>Mantenga sólo las ninfas G1 resultantes de los adultos G0 que contienen mutaciones en su línea germino y deseche las otras.</li>
	</ol></li>
	<li>Genotipado individual de ninfas/adultos G1<ol>
<li>Aísle las ninfas G1 en placas de 24 pozos con un aspirador o un pincel. Coloque las placas de 24 pozos en un recipiente más grande (por ejemplo, el recipiente mediano utilizado en este protocolo) con suministro de agua como se describió anteriormente para mantener un RH del 60%-80%(Figura 1D). Mantener el suministro de alimentos artificiales regulares para el pescado(Figura 1D'). NOTA: Aunque este paso se puede realizar en cualquier punto de las etapas de ninfas y adultos, se recomienda realizarlo después de llegar a la edad adulta y justo antes del emparejamiento (>2.5 meses después de la inyección; Figura 1B) porque es más fácil mantener los ignífugos en un recipiente grande. Se requiere una cría individual para rastrear el genotipo de cada ninfa G1 en los siguientes pasos. Las ninfas G1 del mismo adulto G0 pueden tener mutaciones diferentes.</li>
		<li>Pellizque y tire de cerci y el filamento caudal de una ninfa/adulto usando fórceps y recogerlos en un tubo de 0,2 ml que contenga 50 μL EtOH (almacene las muestras recogidas a -20 °C para un almacenamiento a largo plazo). NOTA: Las muestras de tejido se recogen en etoh porque evita la pérdida de estas pequeñas muestras debido a la electricidad estática. Si uno necesita detener el movimiento de los insectos, anestesia ninfa/adulto en hielo al tomar muestras de tejido. Debido a que T. domestica no puede sobrevivir después del enfriamiento a largo plazo en el hielo, no los anestesia durante más de un minuto e inmediatamente los mueva de vuelta a temperatura ambiente. La ablación del cerci y el filamento caudal no causa un aumento de la mortalidad.</li>
		<li>Coloque tubos de muestra con las tapas abiertas en un bloque térmico durante 15 minutos a 70 °C para evaporar el EtOH.</li>
		<li>Repita los pasos 4.2.2–4.2.5 para genotipado.</li>
		<li>Envíe los productos PCR en los que se observa un patrón de banda mutante a un servicio de secuenciación Sanger estándar.</li>
		<li>Mantenga las ninfas/adultos G1 con las mutaciones deseadas y deseche las demás (consulte la Figura 4C para obtener un resultado representativo de secuenciación).</li>
	</ol></li>
	<li>Cruza a los adultos que contienen las mutaciones deseadas en un plato de apareamiento y obtiene las próximas generaciones para establecer una cepa mutante homocigólica.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Peterson, M. D., Rogers, B. T., Popadi&#263;, A., Kaufman, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+expression+pattern+of+labial,+posterior+homeotic+complex+genes+and+the+teashirt+homologue+in+an+apterygote+insect.">The embryonic expression pattern of labial, posterior homeotic complex genes and the teashirt homologue in an apterygote insect.</a> Development Genes and Evolution. 209, 77-90 (1999).</li><li>Farris, S. 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Exchanges of water with the atmosphere.</a> Journal of Experimental Biology. 50, 745-769 (1969).</li><li>Sweetman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+ecology+of+the+firebrat,+Thermobia+domestica+(Packard).">Physical ecology of the firebrat, Thermobia domestica (Packard).</a> Ecological Monographs. 8, 285-311 (1938).</li><li>Nijhout, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Hormones. , (1994).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+detection,+quantification+and+enrichment+of+subtle+allelic+alterations.">Efficient detection, quantification and enrichment of subtle allelic alterations.</a> DNA Research. 19, 423-433 (2012).</li><li>Mashal, R. D., Koontz, J., Sklar, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+mutations+by+cleavage+of+DNA+heteroduplexes+with+bacteriophage+resolvases.">Detection of mutations by cleavage of DNA heteroduplexes with bacteriophage resolvases.</a> Nature Genetics. 9, 177-183 (1995).</li><li>Adams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+notes+upon+the+firebrat,+Thermobia+domestica+Packard.">Biological notes upon the firebrat, Thermobia domestica Packard.</a> Journal of the New York Entomological Society. 41, 557-562 (1933).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Para la generación exitosa del mutante T. domestica deseado con CRISPR/Cas9, primero es importante recoger un número suficiente de embriones escenificados para la inyección. Para una recolección constante de un número suficiente de huevos T. domestica, la clave es seleccionar un tamaño adecuado del recipiente para tener una menor densidad de población porque ayudaría a completar con éxito una serie de comportamientos complejos de apareamiento, que se repite después de cada muda adulta<sup clas...

Thermobia domestica pertenece a una de las órdenes de insectos más basales, Zygentoma, que conserva un ciclo de vida ancestral ametaboloso y sin alas. Tal posición filogenética basal y características ancestrales establecen a esta especie como un modelo atractivo para estudiar los mecanismos subyacentes al éxito de los insectos en la Tierra, que cubren más del 70% de las especies animales descritas1. T. domestica se ha utilizado durante mucho tiempo principalmente para estudiar las características ancestrales de la fisiología de insectos debido a sus características adecuadas como modelo de laboratorio, como un ciclo de vida relativamente corto (2,5–3,0 meses de embrión a adulto reproductor; Figura 1A) y una cría fácil. En las últimas tres décadas, su uso se ha ampliado para investigar características ancestrales de diversos rasgos como el plan corporal, la diferenciación neuronal y los ritmos circadianos2,3,4.
La aplicación de herramientas genéticas avanzadas en T. domestica podría acelerar aún más esas contribuciones en un amplio área de investigación. Se ha notificado una interferencia exitosa del ARN (ARN) en embriones, ninfas y adultos en T. domestica4,5,6. La eficiencia del RNAi sistémico sigue siendo altamente dependiente de las especies, por ejemplo, generalmente es alta en coleoptera, mientras que es baja en el ordenlepidópteros 7. La eficiencia y duración del derribo de la RNAi en T. domestica aún no ha sido evaluada. Además de RNAi, hemos informado previamente de un exitoso knockout genético mediado por CRISPR/Cas9 en T. domestica8. El sistema CRISPR/Cas se ha aplicado ampliamente para la edición del genoma en insectos, particularmente para el knockout genético específico. Su uso podría ampliarse para otras aplicaciones como el ensayo de reporteros genéticos, el seguimiento del linaje celular y la manipulación de la actividad transcripcional mediante el derribo de construcciones exógenas después del establecimiento de un protocolo para la entrega de componentes del sistema CRISPR/Cas en núcleos9. Combinado con el ensamblaje del genoma publicado10,el uso amplio y el desarrollo posterior de la edición del genoma basado en CRISPR/Cas en T. domestica facilitarían estudios centrados en los mecanismos evolutivos detrás del excepcional éxito adaptativo de los insectos. Aquí, describimos un protocolo detallado para la microinyección embrionaria y para aparear T. domestica adulto para generar una cepa mutante usando CRISPR/Cas9. Teniendo en cuenta este novedoso método, discutimos la importancia de considerar la biología única de las especies modelo no tradicionales para aplicaciones exitosas de estas técnicas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>83-3738</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3, 100 &#181;g</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>1081060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-static cleaner</td>
			<td>Hozan</td>
			<td>Z-292</td>
			<td>for removing static electricity from a 24-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier Box 20.7L</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>4-5606-01</td>
			<td>Large container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FemtoJet 4i</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5252000013</td>
			<td>Electronic microinjector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Femtotip II, injection capillary</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242957000</td>
			<td>Glass injection capillary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Pack 2440mL</td>
			<td>AS ONE</td>
			<td>5-068-25</td>
			<td>Middle-sized container</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>MIR-554-PJ</td>
			<td>for 37 &#176;C incubation. No need to humidify inside the incubator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOD Fx Neo</td>
			<td>Toyobo</td>
			<td>KFX-101</td>
			<td>PCR enzyme for genotyping. Optimized for an amplification from crude templates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stand</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>GJ-8</td>
			<td>for holding the micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microloader</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5242956003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>MM-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX12</td>
			<td>for microinjection. More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiNA</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>MCE-202</td>
			<td>Microchip electrophoresis system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NiceTac</td>
			<td>Nichiban</td>
			<td>NW-5</td>
			<td>Double-sided tape to place eggs on a glass slide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush (horse hair)</td>
			<td>Pentel</td>
			<td>ZBS1-0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant culture dish</td>
			<td>SPL Life Sciences</td>
			<td>310100</td>
			<td>Mating dish and water supplies for a large and middle-sized containers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K, recombinant, PCR Grade Lyophilizate from Pichia pastoris</td>
			<td>Roche</td>
			<td>3115836001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SZX 12 microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX 12</td>
			<td>More than 35X magnification is sufficient for the microinjection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder</td>
			<td>Maruishi</td>
			<td>877113</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tetra Goldfish Gold Growth</td>
			<td>Spectrum Brands</td>
			<td></td>
			<td>Artificial regular fish food</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

egg microinjection and efficient mating for genome editing in the firebrat thermobia domestica

El firebrat Thermobia domestica es una especie ametabolosa y sin alas que es adecuada para estudiar los mecanismos de desarrollo de los insectos que condujeron a su exitosa radiación evolutiva en la Tierra. La aplicación de herramientas genéticas como la edición del genoma es la clave para entender los cambios genéticos que son responsables de las transiciones evolutivas en un enfoque Evo-Devo. En este artículo, describimos nuestro protocolo actual para generar y mantener cepas mutantes de T. domestica. Informamos de un método de inyección en seco, como alternativa al método de inyección húmeda notificado, que nos permite obtener tasas de supervivencia establemente altas en embriones inyectados. También informamos de un entorno optimizado para acoplar adultos y obtener generaciones posteriores con alta eficiencia. Nuestro método subraya la importancia de tener en cuenta la biología única de cada especie para la aplicación exitosa de métodos de edición del genoma a organismos modelo no tradicionales. Predicemos que estos protocolos de edición del genoma ayudarán a implementar T. domestica como modelo de laboratorio y a acelerar aún más el desarrollo y la aplicación de herramientas genéticas útiles en esta especie.

En nuestras manos, alrededor de 100 huevos se pueden inyectar bien con un solo capilar de inyección cuando tiene la punta adecuada(Figura 3C). Inyección de gRNA/Cas9 complejo ribonucleoprotein en embriones dentro de las primeras 8 h después de la puesta de óvulos resulta en indels en el sitio objetivo de gRNA. Esto causa mutaciones biallelicas en algunas células de la generación inyectada (G0) y por lo tanto los fenotipos de mosaico mutantes generalmente se obtienen en G0. Por ejemplo,...

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Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.

Microinyección de óvulos y apareamiento eficiente para la edición del genoma en la thermobia doméstica de firebrat

The firebrat Thermobia domestica is an ametabolous, wingless species that is suitable for studying the developmental mechanisms of insects that led to ...

egg-microinjection-efficient-mating-for-genome-editing-firebrat

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

4.3K vistas.  Kyoto University. Proporcionamos un protocolo detallado para la cría, microinjección de huevos y para el apareamiento eficiente del firebrat Thermobia domestica para generar y mantener cepas mutantes después de la edición del genoma.

Video: Egg Microinjection and Efficient Mating for Genome Editing in the Firebrat Thermobia domestica

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Análisis de pez cebra larvas esquelético Integridad del músculo con el colorante azul de Evans

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Identification of Critical Conditions for Immunostaining in the Pea Aphid Embryos: Increasing Tissue Permeability and Decreasing Background Staining

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental studies. Like other aphids, A. pisum propagate rapidly via parthenogenetic viviparous reproduction, where the embryos develop within egg chambers in an assembly-line fashion in the ovariole. Previously we have established a robust platform of whole-mount in situ hybridization allowing detection of mRNA expression in the aphid embryos. For analyzing the expression of protein, though, established protocols for immunostaining the ovarioles of asexual viviparous aphids did not produce satisfactory results. Here we report conditions optimized for increasing tissue permeability and decreasing background staining, both of which were problems when applying established approaches. Optimizations include: (1) incubation of proteinase K (1 &#181;g/ml, 10 min), which was found essential for antibody penetration in mid- and late-stage aphid embryos; (2) replacement of normal goat serum/bovine serum albumin with a blocking reagent supplied by a Digoxigenin (DIG)-based buffer set and (3) application of methanol rather hydrogen peroxide (H2O2) for bleaching endogenous peroxidase; which significantly reduced the background staining in the aphid tissues. These critical conditions optimized for immunostaining will allow effective detection of gene products in the embryos of A. pisum and other aphids.

A protocol of whole-mount immunostaining on aphid embryos is presented, in which critical conditions for decreasing background staining and increasing tissue permeability are addressed. These conditions are specifically developed for effective detection of protein expression in the embryonic tissues of aphids.

Identificación de las condiciones críticas para inmunotinción en el guisante áfido embriones: El aumento del tejido Permeabilidad y disminución de la tinción de fondo

The pea aphid Acyrthosiphon pisum, with a sequenced genome and abundant phenotypic plasticity, has become an emerging model for genomic and developmental ...

Microinjection for Transgenesis and Genome Editing in Threespine Sticklebacks

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and behavioral phenotypes. The remarkably diverse phenotypes that have evolved as marine populations adapt to countless freshwater environments, combined with the ability to cross marine and freshwater forms, provide a rare vertebrate system in which genetics can be used to map genomic regions controlling evolved traits. Excellent genomic resources are now available, facilitating molecular genetic dissection of evolved changes. While mapping experiments generate lists of interesting candidate genes, functional genetic manipulations are required to test the roles of these genes. Gene regulation can be studied with transgenic reporter plasmids and BACs integrated into the genome using the Tol2 transposase system. Functions of specific candidate genes and cis-regulatory elements can be assessed by inducing targeted mutations with TALEN and CRISPR/Cas9 genome editing reagents. All methods require introducing nucleic acids into fertilized one-cell stickleback embryos, a task made challenging by the thick chorion of stickleback embryos and the relatively small and thin blastomere. Here, a detailed protocol for microinjection of nucleic acids into stickleback embryos is described for transgenic and genome editing applications to study gene expression and function, as well as techniques to assess the success of transgenesis and recover stable lines.

Transgenic manipulations and genome editing are critical for functionally testing the roles of genes and cis-regulatory elements. Here a detailed microinjection protocol for the generation of genomic modifications (including Tol2-mediated fluorescent reporter transgene constructs, TALENs, and CRISPRs) is presented for the emergent model fish, the threespine stickleback.

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

The threespine stickleback fish has emerged as a powerful system to study the genetic basis of a wide variety of morphological, physiological, and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

La microinyección de embriones y la electroporación en el Chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Collection of Post-mating Semen from the Female Reproductive Tract and Measurement of Semen Liquefaction in Mice

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called liquefaction. In this study, we show how to collect the post-ejaculated semen from the female reproductive tract in a mouse model. First, adult female mice in the estrus stage were housed in a male&#39;s cage overnight. The next morning, copulation was confirmed by the presence of copulatory plug at the vaginal opening. Female mice with copulatory plugs were euthanized, and each reproductive tract was collected as a whole (vagina, uterus, oviducts, ovaries), ensuring a closed system to contain the semen. The reproductive tract was placed in a 1.5 mL microcentrifuge tube, and the vagina was cut off to release the semen into the tube. To ensure maximum semen volume for analysis, toothless forceps were used to squeeze the uterine horns from ovarian end to vaginal end expelling remaining semen. The whole reproductive tract was then discarded. The semen-containing tube was briefly spun down. A 25 &#956;L capillary pipette was placed into the tube at a 180&#176; angle (parallel to the tube wall). The amount of time used to fill the capillary tube to the 25 &#956;L line was recorded. Semen from a proven male breeder usually takes approximately 60-180 s to fill a 25 &#956;L capillary tube. This semen collection technique can also be used in other downstream applications such as sperm imaging and motility analysis.

Semen liquefaction is required for sperm to be liberated from the seminal gel. This study provides the procedures for collecting semen from the female reproductive tract post-coitus, and measuring semen liquefaction time.

Colección de postnupcial Semen del aparato reproductor femenino y las mediciones de licuefacción del Semen en ratones

In mice, ejaculated semen is deposited in the uterus. After ejaculation, the semen changes consistency from gel-like to watery, a process called ...

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of cells or tissues in model organisms. These systems contain two components as separate transgenic lines. A driver line expresses a transcriptional activator under the control of tissue-specific promoters/enhancers, and a reporter/effector line harbors a target gene placed downstream to the binding site of the transcription activator. Animals harboring both components induce tissue-specific transactivation of a target gene expression. Precise spatiotemporal expression of the gene in targeted tissues is critical for unbiased interpretation of cell/gene activity. Therefore, developing a method for generating exclusive cell/tissue-specific driver lines is essential. Here we present a method to generate highly tissue-specific targeted expression system by employing a &#34;Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat/CRISPR-associated&#34; (CRISPR/Cas)-based genome editing technique. In this method, the endonuclease Cas9 is targeted by two chimeric guide RNAs (gRNA) to specific sites in the first coding exon of a gene in the Drosophila genome to create double-strand breaks (DSB). Subsequently, using an exogenous donor plasmid containing the transactivator sequence, the cell-autonomous repair machinery enables homology-directed repair (HDR) of the DSB, resulting in precise deletion and replacement of the exon with the transactivator sequence. The knocked-in transactivator is expressed exclusively in cells where the cis-regulatory elements of the replaced gene are functional. The detailed step-by-step protocol presented here for generating a binary transcriptional driver expressed in Drosophila fgf/branchless-producing epithelial/neuronal cells can be adopted for any gene- or tissue-specific expression.

An Efficient Strategy for Generating Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing

Here, we present a method for generating tissue-specific binary transcription systems in Drosophila by replacing the first coding exon of genes with transcription drivers. The CRISPR/Cas9-based method places a transactivator sequence under the endogenous regulation of a replaced gene, and consequently facilitates transctivator expression exclusively in gene-specific spatiotemporal patterns.

Una estrategia eficiente para la generación de sistemas de transcripción binario tejidos específicos en Drosophila genoma editando

Binary transcription systems are powerful genetic tools widely used for visualizing and manipulating cell fate and gene expression in specific groups of ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a general challenge in developmental biology research. In the embryonic heart, this can be particularly difficult as regional differences in the expression of transcriptional regulators, paracrine/juxtacrine signaling cues, and hemodynamic force are all known to influence cardiomyocyte maturation. A simplified method to alter a developing cardiomyocyte's molecular and biomechanical microenvironment would, therefore, serve as a powerful technique to examine how local conditions influence cell fate and function. To address this, we have optimized a method to physically transplant juvenile cardiomyocytes into ectopic locations in the heart or the surrounding embryonic tissue. This allows us to examine how microenvironmental conditions influence cardiomyocyte fate transitions at single cell resolution within the intact embryo. Here, we describe a protocol in which embryonic myocytes can be isolated from a variety of cardiac sub-domains, dissociated, fluorescently labeled, and microinjected into host embryos with high precision. Cells can then be directly analyzed in situ using a variety of imaging and histological techniques. This protocol is a powerful alternative to traditional grafting experiments that can be prohibitively difficult in a moving tissue such as the heart. The general outline of this method can also be adapted to a variety of donor tissues and host environments, and its ease of use, low cost, and speed make it a potentially useful application for a variety of developmental studies.

In this method, embryonic cardiac tissues are surgically microdissected, dissociated, fluorescently labeled, and implanted into host embryonic tissues. This provides a platform for studying the individual or tissue level developmental organization under ectopic hemodynamic conditions, and/or altered paracrine/juxtacrine environments.

Sistema basado en la microinyección en Vivo implantación de cardiomiocitos embrionarios en el embrión aviar

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Brain Organoid Generation from Induced Pluripotent Stem Cells in Home-Made Mini Bioreactors

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology has emerged recently. It is still in its infancy and has some limitations unsolved yet. The current protocols do not allow obtaining organoids to be consistent enough for drug discovery and preclinical studies. The maturation of organoids can take up to a year, pushing the researchers to launch multiple differentiation processes simultaneously. It imposes additional costs for the laboratory in terms of space and equipment. In addition, brain organoids often have a necrotic zone in the center, which suffers from nutrient and oxygen deficiency. Hence, most current protocols use a circulating system for culture medium to improve nutrition.
Meanwhile, there are no inexpensive dynamic systems or bioreactors for organoid cultivation. This paper describes a protocol for producing brain organoids in compact and inexpensive home-made mini bioreactors. This protocol allows obtaining high quality organoids in large quantities.

Here we describe a protocol for generating brain organoids from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). To obtain brain organoids in large quantities and of high quality, we use home-made mini bioreactors.

Generación de organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas en mini biorreactores caseros

The iPSC-derived brain organoid is a promising technology for in vitro modeling the pathologies of the nervous system and drug screening. This technology ...

Zygote Microinjection for Creating Gene Cassette Knock-in and Flox Alleles in Mice

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily produced by electroporation of CRISPR factors (and single-stranded oligo DNA donors) into the zygote. In contrast, gene cassette (&#62;1 kb) knock-in and floxed mice are mainly generated by microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors into zygotes. Genome editing technologies have also increased the flexibility of genetically modified mice production. It is now possible to introduce the intended mutations in the target genomic regions in a number of beneficial inbred mouse strains. Our team has produced over 200 gene cassette knock-in mouse lines, and over 110 floxed mouse lines by zygote microinjection of CRISPR-Cas9 following requests from several countries, including Japan. Some of these genome editing used BALB/c, C3H/HeJ, and C57BL/6N inbred strains, however most used C57BL/6J. Unlike the electroporation method, genome editing by zygote microinjection in various inbred strains of mice is not that easy. However, gene cassette knock-in and floxed mice on single inbred genetic backgrounds are as critical as genetic humanized, fluorescent reporter, and conditional knockout mouse models. Therefore, this article presents the protocol for the zygote microinjection of CRISPR factors and double-stranded DNA donors in C57BL/6J mice for generating gene cassette knock-in and floxed mice. This article exclusively focuses on nuclear injection rather than cytoplasmic injection. In addition to zygote microinjection, we outline the timeline for the production process and peripheral techniques such as induction of superovulation and embryo transfer.

The present protocol describes zygote microinjection of CRISPR-Cas9 and donor DNA to efficiently produce gene cassette knock-in and floxed mice.

Microinyección de cigoto para la creación de alelos de genes de casete knock-in y flox en ratones

CRISPR-Cas technology has enabled the rapid and effortless generation of genetically modified mice. Specifically, mice and point mutant mice are readily ...