지금까지 CRISPR은 소수의 Hemipterans에서만 사용되었습니다. 여기에 요약된 프로토콜은 연구자들이 다른 헤미프테란 종에 CRISPR 및 생식계열 형질전환을 적용하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 건조에 민감한 곤충 배아를 위해 특별히 개발되었습니다.
프로토콜의 많은 단계는 잠재적으로 다른 곤충 종의 결과를 개선할 수 있습니다. 형질전환 플랜트호퍼를 생성하는 능력은 더 이상 바이러스를 전염시킬 수 없는 곤충을 만드는 것과 같은 새로운 제어 방법의 문을 열어줍니다. 이 기술은 서양 꽃 총채벌레와 같은 다른 해충의 유전자 기능을 연구하는 데 혁명적 일 것입니다.
우리는 이 CRISPR 기술을 총채벌레 배아에 적용하여 유망한 결과를 얻었습니다. 우리는 이 시스템에서의 연습이 성공을 위해 필수적이라는 것을 알게 되었습니다. 여기에 표시된 방법은 일상적으로 수행할 때 다양한 설정에서 유연하게 사용할 수 있어야 합니다.
성충 Peregrinus maidis 곤충을 담을 방을 만들려면 1온스 컵 바닥에 구멍을 뚫고 공기 교환을 위해 구멍 위에 스크린을 붙입니다. 일주일 된 성충 암컷 곤충을 선택하려면 식민지를 15밀리리터 원추형 튜브에 1시간 동안 흡인한 후 곤충을 얼음 위에서 잠시 식힙니다. 복부의 복부 쪽에 일반적으로 나머지 복부보다 어두운 산란관의 존재로 여성을 식별합니다.
암컷을 수집 할 때 컵에 옮깁니다. 15 명의 암컷이 선택되면 5 x 5 센티미터의 파라핀 왁스 필름으로 컵을 밀봉하십시오. 400 마이크로 리터의 10 % 자당 용액을 필름 상단에 바르고 두 번째 5 x 5 센티미터 필름을 용액 위에 놓습니다.
플라스틱 파라핀 왁스 필름 면이 산란 배지와 직접 접촉하는 계란 수집 접시에 성체 챔버를 놓고 공기 구멍을 덮지 않고 전체 알을 낳는 챔버를 플라스틱 랩으로 감쌉니다. 그런 다음 챔버를 섭씨 25도에 70% 습도 및 14시간 조명, 10시간 암주기 주기로 놓습니다. 배아 채취를 위해 원하는 알을 낳은 후 1 x 15mm 스트립의 양면 테이프를 22 x 30mm 커버 슬립에 붙이고 커버 슬립을 알을 낳는 챔버의 산란 배지에 놓습니다.
미세 브러시와 해부 현미경을 사용하여 개별 반투명 배아를 한천 표면에서 양면 테이프로 옮깁니다. 약 25개의 배아가 선택되면 바나나 모양의 배아를 옆으로 배열하고 더 큰 끝이 테이프에 붙습니다. 배아의 미세 주입을 위해 먼저 가습 후드 내부의 해부 현미경으로 100% 한천과 같은 높이의 15 x 1 밀리리터 페트리 접시에 덮개 슬립을 놓습니다.
사출 압력을 확인하려면 석영 주입 바늘의 끝을 물 한 방울에 넣고 주입 주기를 시작합니다. 압력 설정을 확인한 후 커버 슬립의 왼쪽에서 접근하여 한 배아의 큰 쪽 끝에 바늘을 삽입하십시오. 주사액을 계란에 넣고 바늘을 빨리 빼냅니다.
계란이 모두 주입되면 덮개 슬립을 새 1% 한천 접시 표면에 놓고 접시를 습도 챔버에 넣습니다. 6 일 후, 깨끗한 물과 미세한 브러시를 사용하여 살아남은 배아를 물에 적신 여과지가 들어있는 35 x 10 밀리미터 페트리 접시에 옮깁니다. 플라스틱 파라핀 왁스 필름으로 페트리 접시를 밀봉하고 부화 챔버를 섭씨 25도 인큐베이터에 넣습니다.
6 일에서 8 일 후, 미세한 브러시를 사용하여 출현 한 첫 번째 instar 님프를 잎사귀 잘라낸 페트리 접시에 옮기고 플라스틱 파라핀 왁스 필름으로 접시를 밀봉합니다. 섭씨 25도에서 48 시간 후, 미세한 브러시를 사용하여 2 일 된 모든 애벌레를 옥수수 식물이있는 사육장으로 옮깁니다. 눈에 보이는 표현형을 가진 주사체가 충분한 수로 회수되면 이러한 곤충을 별도로 케이지하여 다음 세대에서 표적 형질의 회복을 극대화합니다.
필요에 따라 신선한 옥수수 식물로 정기적으로 옮겨 적절한 온도 및 습도 조건에서 곤충을 사육하고 예상되는 표현형에 대해 자손을 정기적으로 선별하여 원하는 표현형을 나타내는 개체를 자신의 케이지에 배치하여 동형 접합 계통을 설정합니다. 이 대표적인 분석에서, 4 주 동안 총 645 명의 암컷으로부터 총 6, 483 개의 알이 수집되었다. 암컷은 일반적으로 2일 후에 알을 낳기 시작하고 4일에서 6일 사이에 대부분의 알을 제공하며 산란 활동은 9일까지 느려집니다.
Cas9 nine injection은 주입 완충액, Cas9이 보충된 주입 완충액, Cas9 및 3개의 가이드 RNA로 보충된 주입 완충액으로 처리된 배아의 발달 속도가 유사하기 때문에 P.maidis 발달에 영향을 미치지 않습니다. 버퍼 및 Cas9 컨트롤의 해치 속도도 비슷합니다. 그러나 3 가이드 믹스를받는 개인의 부화율은 일반적으로 상대적으로 낮습니다.
이 대표적인 실험에서, 발달한 71명의 가이드 주입 개체 중 23명은 어느 정도의 색소 손실을 보였고 9명은 부화하여 약 30%의 녹아웃 비율을 나타냈습니다.3개의 가이드 믹스는 주입된 개체로부터 분리된 게놈 DNA로부터 증폭된 PCR 산물에서 관찰되는 바와 같이 백색 유전자좌로부터 약 180개의 염기쌍을 제거할 것으로 예상되며, 뿐만 아니라 해당 제품에서 생성된 관련 시퀀스 데이터에서. 주사 외상을 최소화하기 위해 경 사진 바늘을 사용하는 것이 좋습니다. 주사 후 배아가 새는 것처럼 보이면 더 나은 결과를 위해 바늘 끝을 검사하십시오.
지속적인 연습은 배아 생존을 증가시킬 것입니다. 현재까지 Hemipterans의 생식계열 형질전환을 설명하는 출판물은 없습니다. 그러나 우리는 이 프로토콜을 사용하여 Cas9 발현 식물 호퍼를 만들었습니다.
전반적으로, Hemipterans에서 생식계열 형질전환을 수행하는 능력은 광범위한 유전적 해충 관리 전략의 문을 열어 살충제 사용을 줄입니다.
