显微镜注射玉米飞虱、 游隼、用于CRISPR/Cas9基因组编辑的胚胎

迄今为止，CRISPR只用于少数半翅目动物。这里概述的方案可以帮助研究人员在其他半翅目物种中应用CRISPR和种系转化。该协议是专门为对干燥敏感的昆虫胚胎开发的。

协议中的许多步骤可能会改善其他昆虫物种的结果。产生转基因飞虱的能力为新的控制方法打开了大门，例如制造不再传播病毒的昆虫。这项技术对于研究其他害虫（如西方花蓟马）的基因功能将是革命性的。

我们已经将这种CRISPR技术应用于蓟马胚胎，并取得了有希望的结果。我们发现，在这个系统中的实践对于成功至关重要。此处显示的方法在常规执行时应允许在各种环境中灵活使用。

为了做一个容纳成年游隼少女昆虫的房间，在一盎司杯子的底部切一个洞，并在孔上粘上一个屏幕以进行空气交换。为了选择一周大的成年雌性昆虫，将菌落吸入15毫升的锥形管中一小时，然后在冰上短暂冷却昆虫。通过腹部腹侧的产卵器的存在来识别雌性，产卵器通常比腹部的其他部分更暗。

收集时将雌性转移到杯子中。当选择了 15 名雌性时，用一块 5 x 5 厘米的石蜡膜密封杯子。将400微升10%蔗糖溶液涂在薄膜顶部，并在溶液上放置第二张5×5厘米的薄膜。

将成虫室放在鸡蛋收集盘上，塑料石蜡膜侧与产卵培养基直接接触，并用保鲜膜包裹整个产卵室，不要覆盖气孔。然后，将腔室置于 25 摄氏度、70% 湿度和 14 小时光照、10 小时黑暗循环下。对于胚胎收集，在所需的产卵期后，将一条 1 x 15 毫米的双面胶带涂在 22 x 30 毫米的盖玻片上，并将盖玻片放在产卵室的产卵培养基上。

使用细刷和解剖显微镜，将单个半透明胚胎从琼脂表面移动到双面胶带上。当选择了大约25个胚胎后，将香蕉形胚胎排列在它们的侧面，较大的末端粘在胶带上。对于胚胎的显微注射，首先，将盖玻片放在100 x 15毫升的培养皿上，在加湿罩内的解剖显微镜下与1%琼脂齐平。

要检查注射压力，请将石英注射针的尖端放入一滴水中并启动注射循环。确认压力设置后，从盖玻片的左侧接近，将针头插入一个胚胎的较大端。将注射液输送到鸡蛋中并快速拔出针头。

当所有鸡蛋都注射完毕后，将盖玻片放在新的1%琼脂培养皿的表面上，然后将培养皿放入湿度室中。六天后，使用清水和细刷将任何幸存的胚胎转移到含有水润滤纸的 35 x 10 毫米培养皿中。用塑料石蜡膜密封培养皿，并将孵化室置于25摄氏度的培养箱中。

六到八天后，用细刷将任何涌现的第一龄若虫转移到叶屑培养皿中，并用塑料石蜡膜密封培养皿。在25摄氏度下48小时后，用细刷将所有两天大的若虫转移到有玉米植物的饲养笼中。如果具有可见表型的注射者被回收到足够数量，则分别笼养这些昆虫，以最大限度地提高下一代目标性状的恢复。

在适当的温度和湿度条件下饲养昆虫，必要时定期转移到新鲜玉米植株上，并定期筛查后代的预期表型，将表现出所需表型的个体放入自己的笼子中以建立纯合子系。在这项具有代表性的分析中，在四周内共从645名雌性中收集了6，483个卵子。雌性通常在两天后开始产卵，并在第四天到第六天提供大部分卵，到第九天产卵活动减慢。

Cas9 9注射不影响P.maidis的发育，因为用注射缓冲液、补充Cas9的注射缓冲液以及补充Cas9和三个引导RNA的注射缓冲液处理的胚胎的发育速率相似。缓冲液和 Cas9 对照的孵化率也相似。然而，接受三导向混合物的个体的孵化率通常相对较低。

在这个代表性的实验中，在发育的71个引导注射个体中，23个显示出一定程度的色素损失，9个孵化，导致敲除率约为30%三向导混合物预计将从白色位点中去除约180个碱基对，如从注射个体分离的基因组DNA扩增的PCR产物中观察到的那样， 以及从这些产品生成的相关序列数据。我们建议使用斜针以尽量减少注射创伤。如果注射后胚胎似乎泄漏，请检查您的针尖以获得更好的结果。

继续练习将增加胚胎存活率。迄今为止，还没有描述半翅目动物种系转化的出版物。然而，我们已经使用该协议来制造表达Cas9的飞虱。

总体而言，在半翅目动物中进行种系转化的能力为广泛的遗传害虫管理策略打开了大门，从而减少了杀虫剂的使用。