На сегодняшний день CRISPR использовался только у нескольких полужесткокрылых. Протокол, изложенный здесь, может помочь исследователям применить CRISPR и трансформацию зародышевой линии у других видов полужесткокрылых. Этот протокол был разработан специально для эмбрионов насекомых, чувствительных к высыханию.
Многие шаги в протоколе потенциально могут улучшить результаты для других видов насекомых. Способность генерировать трансгенных кузнечиков открывает двери для новых методов борьбы, таких как создание насекомых, которые больше не могут передавать вирусы. Этот метод будет революционным для изучения функции генов у других вредителей, таких как западный цветочный трипс.
Мы адаптировали этот метод CRISPR для эмбрионов трипсов с многообещающими результатами. Мы считаем, что практика в этой системе необходима для успеха. Показанные здесь методы, при регулярном выполнении должны обеспечивать гибкое использование в различных условиях.
Чтобы сделать камеру для содержания взрослых насекомых Peregrinus maidis, вырежьте отверстие в дне чашки весом в одну унцию и приклейте над отверстием экран для воздухообмена. Для отбора однонедельных взрослых самок насекомых аспирируйте колонию в коническую трубку объемом 15 миллилитров в течение одного часа, прежде чем ненадолго охладить насекомых на льду. Идентифицируют самок по наличию яйцеклада, который обычно темнее, чем остальная часть брюшка, на брюшной стороне брюшка.
Пересаживайте самок в чашку по мере их сбора. Когда будет отобрано 15 самок, запечатайте чашку куском парафиновой восковой пленки размером пять на пять сантиметров. Нанесите 400 микролитров 10%-ного раствора сахарозы на верхнюю часть пленки и поместите второй кусок пленки размером пять на пять сантиметров поверх раствора.
Поместите взрослую камеру на чашку для сбора яиц так, чтобы пластиковая парафиновая пленка находилась в непосредственном контакте со средой для яйцекладки, и оберните всю камеру для откладывания яиц полиэтиленовой пленкой, не закрывая отверстия для воздуха. Затем поместите камеру при температуре 25 градусов по Цельсию с влажностью 70% и 14-часовым светом, 10-часовым темным циклом. Для сбора эмбрионов после желаемого периода откладывания яиц наложите полоску двустороннего скотча размером один на 15 миллиметров на защитное стекло размером 22 на 30 миллиметров и поместите покровное стекло на среду для яйцекладки камеры для яйцекладки.
Используя тонкую кисть и препарирующий микроскоп, переместите отдельные полупрозрачные эмбрионы с поверхности агара на двусторонний скотч. Когда будет отобрано около 25 эмбрионов, расположите бананообразные эмбрионы на боку так, чтобы большие концы были воткнуты в ленту. Для микроинъекции эмбрионов сначала поместите покровное стекло на чашку Петри размером 100 на 15 миллилитров заподлицо с 1%-ным агаром под препарирующим микроскопом внутри увлажненного колпака.
Чтобы проверить давление впрыска, поместите кончик кварцевой иглы в каплю воды и инициируйте цикл впрыска. После подтверждения установки давления, подойдя с левой стороны покровного листа, введите иглу в больший конец одного эмбриона. Доставьте инъекционный раствор в яйцо и быстро вытащите иглу.
Когда все яйца будут введены, поместите крышку на поверхность новой чашки с 1%-ным агаром и поместите блюдо во влажную камеру. Через шесть дней используйте чистую воду и тонкую щетку, чтобы перенести выжившие эмбрионы в чашку Петри размером 35 на 10 миллиметров, содержащую увлажненную водой фильтровальную бумагу. Запечатайте чашку Петри пластиковой парафиновой пленкой и поместите инкубационную камеру в инкубатор с температурой 25 градусов Цельсия.
Через шесть-восемь дней с помощью тонкой кисти перенесите любых появившихся нимф первого возраста в чашку Петри с обрезками листьев и запечатайте чашку пластиковой парафиновой пленкой. Через 48 часов при температуре 25 градусов по Цельсию используйте тонкую щетку, чтобы перенести всех двухдневных нимф в клетку для выращивания кукурузы. Если инъекционные с видимым фенотипом восстанавливаются в достаточном количестве, посадите этих насекомых в клетку отдельно, чтобы максимизировать восстановление целевого признака в следующем поколении.
Выращивайте насекомых в соответствующих условиях температуры и влажности с регулярными переносами на свежие растения кукурузы по мере необходимости и регулярно проверяйте потомство на наличие ожидаемых фенотипов, помещая особей, демонстрирующих желаемый фенотип, в свои собственные клетки для установления гомозиготных линий. В этом репрезентативном анализе за четыре недели было собрано в общей сложности 6 483 яйца у 645 самок. Самки обычно начинают откладывать яйца через два дня и обеспечивают большую часть яиц с четвертого по шестой день, при этом активность яйцекладки замедляется к девятому дню.
Девятая инъекция Cas9 не влияет на развитие P.maidis, так как скорость развития эмбрионов, обработанных инъекционным буфером, инъекционным буфером, дополненным Cas9, и инъекционным буфером, дополненным Cas9 и тремя направляющими РНК, одинакова. Скорость штриховки для буфера и элементов управления Cas9 также аналогична. Тем не менее, частота вылупления особей, получающих смесь с тремя направляющими, обычно относительно ниже.
В этом репрезентативном эксперименте из 71 человека, получившего инъекцию направляющими, 23 показали некоторую степень потери пигмента, а девять вылупились, что привело к частоте нокаутов около 30%Ожидается, что смесь из трех направляющих удалит примерно 180 пар оснований из белого локуса, как это наблюдается в продуктах ПЦР, амплифицированных из геномной ДНК, выделенной у инъецированных людей. а также в связанных данных последовательности, сгенерированных из этих продуктов. Мы рекомендуем использовать скошенные иглы, чтобы свести к минимуму травму от инъекций. Если после инъекции кажется, что эмбрионы протекают, осмотрите кончики игл для достижения лучших результатов.
Продолжение практики повысит выживаемость эмбрионов. На сегодняшний день нет публикаций, описывающих трансформацию зародышевой линии у полужесткокрылых. Тем не менее, мы использовали этот протокол для создания Cas9-экспрессирующих кузнечиков.
В целом, способность выполнять трансформацию зародышевой линии у полужесткокрылых открывает двери для широкого спектра генетических стратегий борьбы с вредителями, тем самым сокращая использование инсектицидов.
