Ad oggi, CRISPR è stato utilizzato solo in una manciata di emitteri. Il protocollo qui delineato potrebbe aiutare i ricercatori ad applicare CRISPR e la trasformazione germinale in altre specie di emitteri. Questo protocollo è stato sviluppato specificamente per gli embrioni di insetti sensibili all'essiccazione.
Molti passaggi del protocollo potrebbero potenzialmente migliorare i risultati in altre specie di insetti. La capacità di generare cavallette transgeniche apre la porta a nuovi metodi di controllo, come la creazione di insetti che non possono più trasmettere virus. Questa tecnica sarà rivoluzionaria per studiare la funzione genica in altri parassiti, come i tripidi dei fiori occidentali.
Abbiamo adattato questa tecnica CRISPR per embrioni tripidi con risultati promettenti. Riteniamo che la pratica in questo sistema sia essenziale per il successo. I metodi mostrati qui, se eseguiti di routine, dovrebbero consentire un uso flessibile in una varietà di impostazioni.
Per fare una camera per contenere gli insetti adulti Peregrinus maidis, tagliare un buco sul fondo di una tazza da un'oncia e incollare uno schermo sopra il foro per lo scambio d'aria. Per la selezione di insetti femmina adulti di una settimana, aspirare la colonia in un tubo conico da 15 millilitri per un'ora, prima di raffreddare brevemente gli insetti sul ghiaccio. Identificare le femmine dalla presenza dell'ovopositore, che è tipicamente più scuro rispetto al resto dell'addome, sul lato ventrale dell'addome.
Trasferisci le femmine nella tazza man mano che vengono raccolte. Quando sono state selezionate 15 femmine, sigillare la tazza con un pezzo di cinque centimetri di pellicola di cera di paraffina. Applicare 400 microlitri di una soluzione di saccarosio al 10% sulla parte superiore del film e posizionare un secondo pezzo di pellicola di cinque per cinque centimetri sopra la soluzione.
Posizionare la camera per adulti su un piatto per la raccolta delle uova con il lato della pellicola di paraffina di plastica a diretto contatto con il mezzo di deposizione delle uova e avvolgere l'intera camera di deposizione delle uova con pellicola trasparente senza coprire i fori d'aria. Quindi, posizionare la camera a 25 gradi Celsius con il 70% di umidità e 14 ore di luce, ciclo di buio di 10 ore. Per la raccolta degli embrioni, dopo il periodo di deposizione degli ovociti desiderato, applicare una striscia di nastro biadesivo da 15 millimetri su un vetrino di copertura da 22 x 30 millimetri e posizionare il vetrino di copertura sul mezzo di deposizione delle uova della camera di deposizione delle uova.
Utilizzando un pennello sottile e un microscopio da dissezione, spostare i singoli embrioni semitrasparenti dalla superficie dell'agar al nastro biadesivo. Quando sono stati selezionati circa 25 embrioni, disporre gli embrioni a forma di banana sui lati con le estremità più grandi incollate sul nastro. Per la microiniezione degli embrioni, in primo luogo, posizionare il vetrino di copertura su una capsula di Petri da 100 x 15 millilitri a filo con l'1% di agar sotto un microscopio da dissezione all'interno di una cappa umidificata.
Per controllare la pressione di iniezione, posizionare la punta di un ago per iniezione di quarzo in una goccia d'acqua e avviare il ciclo di iniezione. Dopo aver confermato l'impostazione della pressione, avvicinandosi dal lato sinistro del vetrino di copertura, inserire l'ago nell'estremità più grande di un embrione. Somministrare la soluzione per iniezione nell'uovo ed estrarre rapidamente l'ago.
Quando tutte le uova sono state iniettate, posizionare la linguetta di copertura sulla superficie di una nuova capsula di agar all'1% e posizionare la capsula in una camera di umidità. Dopo sei giorni, utilizzare acqua pulita e pennello fine per trasferire gli embrioni sopravvissuti in una capsula di Petri da 35 x 10 millimetri contenente carta da filtro inumidita con acqua. Sigillare la capsula di Petri con pellicola di paraffina di plastica e posizionare la camera di schiusa in un'incubatrice a 25 gradi Celsius.
Dopo sei-otto giorni, usa un pennello fine per trasferire eventuali ninfe emergenti di primo stadio in una capsula di Petri di ritagli di foglie e sigilla il piatto con pellicola di cera di paraffina di plastica. Dopo 48 ore a 25 gradi Celsius, usa un pennello sottile per trasferire tutte le ninfe di due giorni in una gabbia di allevamento con piante di mais. Se gli iniettati con fenotipo visibile vengono recuperati in numero sufficiente, ingabbiare questi insetti separatamente per massimizzare il recupero del tratto bersaglio nella generazione successiva.
Allevare gli insetti nelle condizioni appropriate di temperatura e umidità con trasferimenti regolari alle piante di mais fresco, se necessario, e selezionare regolarmente la progenie per i fenotipi attesi, mettendo gli individui che mostrano il fenotipo desiderato nelle proprie gabbie per stabilire linee omozigoti. In questa analisi rappresentativa, un totale di 6.483 uova sono state raccolte da un totale di 645 femmine in quattro settimane. Le femmine in genere iniziano a deporre le uova dopo due giorni e forniscono la maggior parte delle uova dal quarto al sesto giorno, con l'attività di deposizione delle uova che rallenta dal nono giorno.
Cas9 nove iniezione non influisce sullo sviluppo di P.maidis, poiché i tassi di sviluppo per gli embrioni trattati con tampone iniettabile, tampone iniettabile integrato con Cas9 e tampone iniettabile integrato con Cas9 e tre RNA guida, è simile. Anche le velocità di tratteggio per i controlli buffer e Cas9 sono simili. Tuttavia, i tassi di tratteggio degli individui che ricevono il mix di tre guide sono in genere relativamente più bassi.
In questo esperimento rappresentativo, dei 71 individui iniettati con guida che si sono sviluppati, 23 hanno mostrato un certo grado di perdita di pigmento e nove si sono schiusi, con un conseguente tasso di knockout di circa il 30% Il mix a tre guide dovrebbe rimuovere circa 180 coppie di basi dal locus bianco, come osservato nei prodotti PCR amplificati dal DNA genomico isolato da individui iniettati, nonché nei dati di sequenza associati generati da tali prodotti. Si consiglia l'uso di aghi smussati per ridurre al minimo il trauma da iniezione. Se gli embrioni sembrano fuoriuscire dopo l'iniezione, esaminare le punte dell'ago per ottenere risultati migliori.
La pratica continua aumenterà la sopravvivenza degli embrioni. Ad oggi, non ci sono pubblicazioni che descrivono la trasformazione germinale negli emitteri. Tuttavia, abbiamo usato questo protocollo per realizzare cavallette che esprimono Cas9.
Nel complesso, la capacità di eseguire la trasformazione germinale negli emitteri apre la porta a una vasta gamma di strategie genetiche di gestione dei parassiti, riducendo così l'uso di insetticidi.
