El cultivo de órganos tipo Trowell se utiliza para cultivar explantes de tejidos. Aquí, mostramos cómo usar este método para estudiar las células madre en dientes de crecimiento continuo. Con esta técnica, podemos estudiar las células madre y su comportamiento en el nicho y detectar el efecto de varias moléculas en la supervivencia y mantenimiento de las células madre.
Este método también se puede aplicar para estudiar las células madre de otros órganos, como la piel o la glándula mamaria. Comience colocando rejillas metálicas de 30 milímetros con orificios de uno a dos milímetros de diámetro en una placa de Petri de 35 milímetros. Llene el lugar con medios hasta que el medio llegue a la superficie de la cuadrícula.
Luego, incubar la placa a 37 grados centígrados hasta que el tejido esté aislado y listo para cultivar. Después de decapitar al ratón, retire la piel para exponer la mandíbula y corte a través de los músculos maseteros para separar la mandíbula del maxilar y el resto de la cabeza. Una vez aislada la mandíbula, retire la lengua y el máximo tejido blando.
Dividir la mandíbula en la línea media cortando a través de la sínfisis. Coloque la mandíbula en la placa de Petri que contiene PBS sobre el hielo. Use una aguja hipodérmica desechable de calibre 20 por 26 para diseccionar el incisivo.
Luego, limpie el tejido blando y el tejido muscular de la superficie ósea para una mejor visualización. Para las mandíbulas obtenidas de animales menores de 10 días, use agujas hipodérmicas desechables de calibre 20 por 26 para abrir cada mitad de la mandíbula longitudinalmente para exponer el diente incisivo. Separe suavemente el incisivo del hueso circundante.
Corte el extremo proximal que contiene el asa cervical y retire el esmalte mineralizado y la matriz de dentina. Mantenga los extremos proximales recolectados en el PBS de Dulbecco en hielo hasta que estén listos para el cultivo. Para ratones mayores de 10 días, abra cada mitad de la mandíbula longitudinalmente para exponer el diente incisivo.
Use pinzas para agarrar la mandíbula y romper el hueso para exponer el diente. Corte el extremo proximal que contiene el asa cervical. Mantenga los extremos proximales recolectados en el PBS de Dulbecco en hielo hasta que estén listos para el cultivo.
Coloque cuidadosamente los filtros rectangulares en la parte superior de la rejilla en un plato de cultivo precalentado y oriente adecuadamente las piezas de tejido. Incubar la placa a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 90 a 95% de humedad. Cambie cuidadosamente el medio en días alternos, evitando la formación de burbujas de aire.
Controle el crecimiento del tejido y capture imágenes diariamente. Retire el medio de cultivo del plato y agregue cuidadosamente metanol helado al tejido. Luego, incubar durante cinco minutos.
Transfiera un filtro que lleve el explante de tejido al tubo de muestreo lleno de solución de fijación. Fijar el explante en paraformaldehído al 4% preparado en PBS para un máximo durante la noche a cuatro grados centígrados. Las células madre epiteliales residen en un nicho llamado asa cervical, ubicado en el extremo proximal del incisivo.
El asa cervical comprende un epitelio del esmalte interno y externo que encierra el retículo estrellado, un núcleo de células epiteliales poco dispuestas. Cada incisivo tiene un asa cervical labial y una lingual, pero solo el asa cervical labial contiene las células madre. Se capturó el extremo proximal de un incisivo, aislado de ratones Sox2-GFP postnatales de dos días, lo que permitió la identificación y visualización de las células madre epiteliales incisivas que expresan Sox2.
En asas cervicales aisladas de ratones transgénicos rojos Sox2-GFP y Fucci, se identificaron células madre GFP positivas y células no proliferativas positivas para rojo de Fucci. La expresión de Sox2-GFP se utilizó como reportero para analizar el efecto del activador de señalización Wnt/beta-catenina BIO, que afectó negativamente a las células madre que expresan Sox2, así como a la expresión de GFP. Esta técnica se puede optimizar para obtener imágenes en vivo del comportamiento de las células madre.
Los explantes prensados o cultivados también se pueden procesar enzimáticamente a suspensiones unicelulares para su posterior análisis.
