Die Leber ist ein primärer Ort für die Transplantation im klinischen Umfeld der menschlichen Inseln. Die intrahepatische Inseltransplantation von Mäusen ist technisch eine Herausforderung, und ein hoher Prozentsatz der Mäuse könnte an chirurgischen Komplikationen, insbesondere Blutungen, sterben. In dieser Studie konnten die beiden Methoden, die wir gezeigt haben, beide den blutungsbedingten Maustod effektiv verhindern.
Unsere Methode kann auf die Erforschung von Leberkrebs und anderen Lebererkrankungen angewendet werden, indem die Injektion von Krebszellen, mesenchymalen Stammzellen und Hepatozyten direkt in die Leber ermöglicht wird. Lösen Sie zunächst eine menschliche Inselkultur mit sanftem Kratzen. Verwenden Sie eine 1-Kubikzentimeter-Spritze, um 300 bis 350 Inseln in sterile 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis aufzunehmen.
Wenn alle Inseln entnommen wurden, zentrifugieren Sie die Röhrchen für 10 Sekunden, um die Zellen zu sedimentieren. Verwerfen Sie alle bis auf ein kleines Volumen Überstands, um den Verlust von Pellets zu verhindern, und suspendieren Sie die Inseln in 200 Mikrolitern HBSS mit 5% BSA. Laden Sie die suspendierten Inseln in eine 5-Milliliter-Insulinspritze und drehen Sie das Spritzennadelende für 1 Minute nach oben, damit sich die Inseln am Kolben absetzen können.
Drücken Sie den Kolben, um Blasen zu entfernen, halten Sie etwa 100 bis 150 Mikroliter Lösung in der Spritze und drehen Sie die Spritze mit sanftem Klopfen um, um die Inseln gleichmäßig zu verteilen. Nachdem Sie eine mangelnde Reaktion auf den Pedalreflex bestätigt haben, tragen Sie Salbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Rasieren Sie den Bauch der betäubten Maus, um das Fell zu entfernen, und desinfizieren Sie den Operationsbereich mit drei abwechselnden Tüchern von 2% Jod und 75% Alkohol.
Als nächstes machen Sie einen 1 bis 1,5 Zentimeter großen Schnitt im Bauch und öffnen Sie die Peritonealhöhle. Legen Sie ein steriles Stück Gaze um den Einschnitt und verwenden Sie Pinzetten oder Baumwollspitzen, um den Darm vorsichtig auf die Gaze zu übertragen. Die bedecken dann den Darm mit einem Stück salzgetränkter Gaze und legen die Pfortader frei.
Um Inseltransfer-induzierte Blutungen mit Gelschaum zu stoppen, halten Sie die Nadel mit der Fase nach unten und positionieren Sie die Nadelspitze mit der Öffnung parallel zur Pfortaderwand, bevor Sie die Nadel in die Pfortader einführen. Ziehen Sie den Kolben ein, um 20 bis 50 Mikroliter Blut in die Spritze zu ziehen, um sie mit den Inseln zu vermischen, bevor Sie die Inseln in die Pfortader infundieren, während Sie den Kolben wiederholt drücken und zurückziehen. Wenn alle Inseln geliefert wurden, legen Sie ein etwa 5 x 5 Zentimeter großes Stück Gelschaum über die Injektionsstelle.
Verwenden Sie eine Baumwollspitze, um den Gelschaum nach unten zu drücken, während Sie die Nadel aus der Pfortader entfernen. Halten Sie das Gel etwa 2 Minuten an Ort und Stelle und rollen Sie den Gelschaum, um sicherzustellen, dass er die Pfortader bedeckt. Sobald die Blutung gestoppt ist, bringen Sie den Darm vorsichtig in die Bauchhöhle in der ursprünglichen Position zurück und injizieren Sie 500 Mikroliter warme Kochsalzlösung in die Bauchhöhle.
Verwenden Sie Nähte, um die Muskel- und Hautschichten zu schließen. Legen Sie die Maus dann in einen sauberen Käfig auf einem Heizkissen mit Überwachung bis zur vollständigen Wiederherstellung von der Anästhesie, verabreichen Sie Analgetika alle 12 Stunden und erhitzen Sie für 48 Stunden. Um Inseltransfer-induzierte Blutungen mit einem Fettpolster zu stoppen, verwenden Sie nach der Freilegung der Pfortader wie gezeigt zwei Baumwollspitzen, um die freiliegende Vene auf der linken und rechten Seite zu halten und das Fettgewebepolster zwischen dem Zwölffingerdarm und der Pfortader zu lokalisieren.
Penetrieren Sie das Fettpolster mit der Nadelspitze, bevor Sie es in die Pfortader einführen. Gießen Sie die Inseln in die Pfortader, wie gezeigt. Wenn alle Inseln geliefert wurden, drücken Sie das Fettgewebe mit einer Baumwollspitze für ca. 1 Minute, während Sie die Nadel aus der Vene entfernen.
Bringen Sie dann den Darm in die Bauchhöhle zurück und führen Sie den Rest der postoperativen Pflegeverfahren wie gezeigt durch. Die Auswirkungen der Inseltransplantation sind dosisabhängig, da eine normale Glykämie 30 Tage nach der syngenen Inseltransplantation beobachtet wird, wenn 500 Inseln übertragen werden, aber nur eine vorübergehende Normoglykämie beobachtet wird, wenn 250 Inseln geliefert werden, wobei die Mäuse 10 Tage nach der Transplantation zur Hyperglykämie zurückkehren. Ein erhöhtes Körpergewicht wird in beiden Gruppen beobachtet und identische Reaktionen beobachtet, wenn menschliche Inseln in diabetische NOD-SCID-Mäuse transplantiert werden, wobei Normoglykämie beobachtet wird, wenn eine höhere Anzahl von Inseläquivalenten transplantiert wird, aber keine kleinere Anzahl.
Die Mehrheit der Mäuse, die nach dem Transfer Blutungen haben, sterben nach der Operation, während die Mäuse ohne Blutungen überleben. 28 Tage nach der Transplantation zeigt die Insulinfärbung eine gleichmäßige Verteilung der menschlichen Insel in der gesamten Leber, meist in der Nähe von Blutgefäßen. Neben Insulin werden auch Fibrin und polymorphe Zellfiltration innerhalb der transplantierten menschlichen Inseln beobachtet.
Die intrahepatische Inseltransplantation erzeugt ein großes Loch in der Pfortadere, das Blutungen verursachen kann. Die Verwendung unserer beiden verbesserten Verfahren kann Blutungen verhindern und die Mortalität nach der Inseltransplantation reduzieren. Das intraportale Inseltransplantationsmodell kann die klinische Transplantation menschlicher Inseln nachahmen.
Unsere verfeinerten Verfahren können zu höheren Überlebensraten für die Empfänger führen, die eine weitere Untersuchung der Inselfunktion nach der Transplantation ermöglichen.
