O fígado é um local primário para transplante no cenário clínico da ilhota humana. O transplante de ilhotas intrahepticas de camundongos é tecnicamente desafiador, e uma alta porcentagem de camundongos pode morrer de complicações cirúrgicas, especialmente sangramento. Neste estudo, os dois métodos que mostramos ambos poderiam efetivamente prevenir a morte do camundongo induzida por sangramento.
Nosso método pode ser aplicado a pesquisas em câncer de fígado e outras doenças hepáticas, permitindo a injeção de células cancerígenas, células-tronco mesenquimais e hepatocitte diretamente no fígado. Para começar, desprende uma cultura de ilhotas humanas com arranhões suaves. Use uma seringa de 1 centímetro cúbico para colher de 300 a 350 ilhotas em tubos de microcentrífugo estéreis de 1,5 mililitro no gelo.
Quando todas as ilhotas tiverem sido colhidas, centrifufique os tubos por 10 segundos para sedimentar as células. Descarte todos, exceto um pequeno volume de supernascer para evitar a perda de pelotas e resuspenque as ilhotas em 200 microliters HBSS contendo 5%BSA. Carregue as ilhotas resuspended em uma seringa de insulina de 5 mililitros e gire a agulha da seringa-final por 1 minuto para deixar as ilhotas se instalarem no êmbolo.
Deprimir o êmbolo para remover quaisquer bolhas, mantendo aproximadamente 100 a 150 microliters de solução na seringa e inverta a seringa com toques suaves para distribuir uniformemente as ilhotas. Após confirmar a falta de resposta ao reflexo do pedal, aplique pomada nos olhos para evitar a secagem. Raspe o abdômen do camundongo anestesiado para remover a pele e desinfetar a área cirúrgica com três lenços alternados de 2% de iodo e 75% de álcool.
Em seguida, faça uma incisão de 1 a 1,5 centímetros no abdômen e abra a cavidade peritoneal. Coloque um pedaço estéril de gaze ao redor da incisão e use fórceps ou pontas de algodão para transferir suavemente o intestino para a gaze. Em seguida, cubra o intestino com um pedaço de gaze encharcada de soro fisiológico e exponha a veia portal.
Para parar o sangramento induzido pela transferência de ilhotas usando espuma de gel, segure a agulha com o bisel virado para baixo e posicione a ponta da agulha com a abertura paralela à parede da veia do portal antes de inserir a agulha na veia do portal. Retraia o êmbolo para atrair 20 a 50 microlitres de sangue na seringa para misturar com as ilhotas antes de infundir as ilhotas na veia do portal enquanto repetidamente deprimida e retraída o êmbolo. Quando todas as ilhotas tiverem sido entregues, coloque um pedaço de espuma de gel de aproximadamente 5 por 5 centímetros sobre o local da injeção.
Use uma ponta de algodão para pressionar a espuma de gel para baixo enquanto remove a agulha da veia do portal. Mantenha o gel no lugar por cerca de 2 minutos, rolando a espuma de gel para ter certeza de que cobre a veia do portal. Uma vez que o sangramento é interrompido, retorne suavemente o intestino para a cavidade peritoneal na posição original e injete 500 microliters de soro fisiológico quente na cavidade abdominal.
Use suturas para fechar as camadas musculares e de pele. Em seguida, coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recuperação completa da anestesia, administrando analgesia a cada 12 horas e aqueça por 48 horas. Para parar o sangramento induzido pela transferência de ilhotas usando uma almofada de gordura, depois de expor a veia portal como demonstrado, use duas pontas de algodão para segurar a veia exposta nos lados esquerdo e direito e localizar a almofada de tecido adiposo entre o duodeno e a veia portal.
Penetre a almofada de gordura com a ponta da agulha antes da inserção na veia portal. Infunda as ilhotas na veia portal como demonstrado. Quando todas as ilhotas tiverem sido entregues, pressione o tecido adiposo com uma ponta de algodão por cerca de 1 minuto enquanto retira a agulha da veia.
Em seguida, devolva o intestino à cavidade abdominal e realize o resto dos procedimentos de cuidados pós-cirúrgicos como demonstrado. Os efeitos do transplante de ilhotas são dependentes de dose, uma vez que a glicemia normal é observada 30 dias após o transplante de ilhotas sinéricas quando 500 ilhotas são transferidas, mas apenas a normolicemia transitória é observada quando 250 ilhotas são entregues, com os camundongos retornando à hiperglicemia por 10 dias após o transplante. Um aumento do peso corporal é observado em ambos os grupos e respostas idênticas observadas quando as ilhotas humanas são transplantadas em camundongos diabéticos NOD-SCID, com normogliccemia observada quando maior número de equivalentes de ilhotas são transplantados, mas não números menores.
A maioria dos camundongos que sangraram após a transferência morrem após a cirurgia, enquanto os ratos sem sangramento sobrevivem. Aos 28 dias após o transplante, a coloração da insulina revela uma distribuição uniforme da ilhota humana em todo o fígado, principalmente perto dos vasos sanguíneos. Além da filtragem de células de insulina, fibrina e polimorfonuclear também são observadas dentro das ilhotas humanas transplantadas.
O transplante de ilhotas intrahápticas vai gerar um grande buraco na veia portal que pode causar sangramento. O uso de nossos dois procedimentos melhorados pode prevenir sangramento e reduzir o transplante pós-ilhota de mortalidade. O modelo de transplante de ilhotas intraportais pode imitar o transplante clínico de ilhotas humanas.
Nossos procedimentos refinados podem levar a maiores taxas de sobrevivência para os receptores, o que permite um estudo mais aprofundado da função de ilhotas após o transplante.
