이 프로토콜은 새로운 췌장 인traatic 생체 내 이미징 창이있는 췌장의 생체 내 이미징에서 안정화되고 반복적인 세포 수준을 설명합니다. 이 기술의 주요 장점은 살아있는 마우스의 췌장에서 3 주 동안 세포 수준까지 해상도를 가진 움직이지 않고 3 차원 이미징을 수행 할 수 있다는 것입니다. 먼저 수술 플랫폼을 준비하고 70%에탄올로 표면을 소독합니다.
마취 후, 동종 요법 제어 가열 패드와 직장 프로브를 사용하여 체온을 모니터링합니다. 마우스의 왼쪽 측면에서 머리카락을 제거하고 알코올과 요오드를 적용하여 절개 부위에서 외부 표면으로 회전하고 절개 부위로 돌아가지 않고 요오드로 끝납니다. 그런 다음 마우스왼쪽 측면에 1.5센티미터 절개를 하여 피부와 근육을 해부합니다.
검은 색 또는 나일론 4-0 봉합사를 사용하여 절개 여백에서 지갑 문자열 봉합사를 수행하십시오. 링 집게로 비장을 조심스럽게 당기고 췌장을 식별합니다. 창을 마우스 측면에 놓고 비장과 췌장을 창의 열린 공간을 통과합니다.
그런 다음 창의 열린 공간에 비장을 놓으면서 이미징 창의 접시에 췌장을 부드럽게 놓습니다. PANC-1 누클레타를 췌장에 직접 삽입합니다. 31 게이지 카테터 바늘을 사용하여 n-부틸 시아노아크라일트 접착제를 이미징 창의 여백에 적용하여 최소한의 접착제가 적용되도록 합니다.
이미징 창의 여백에 12mm 원형 커버 글래스를 부드럽게 발라주세요. 그런 다음 봉합사 루프를 잡고 창의 측면 홈에 맞게 세 번 묶습니다. 마지막으로, 마우스가 깨어있을 때 이러한 단단한 바늘의 중단을 방지하기 위해, 넥타이의 최대 근접 부위를 잘라.
레이저 전력을 포함한 인트라비티드 현미경을 전환하여 시작합니다. 혈관 카테터를 삽입하려면 인덱스와 세 번째 손가락으로 꼬리의 근근 면에 압력을 가하십시오. 필요한 경우 램프로 꼬리를 가열합니다.
70%에탄올 스프레이로 꼬리 정맥을 소독한 다음 30 게이지 카테터를 측면 꼬리 정맥에 삽입하고 PE-10 튜브에서 혈액의 역류를 시각화합니다. 카테터에 실크 테이프를 바르면 안정화하십시오. 형광 프로브의 조합에 따라 FITC dextran 및 TMR dextran 또는 기타 형광 프로브를 적절히 주입하십시오.
직장 프로브를 삽입하여 홈더믹 가열 패드 시스템으로 체온을 자동으로 제어합니다. 그런 다음, 창 홀더에 중요한 현미경 검사법 설정 중에 준비된 췌장 이미징 창을 삽입한다. 수술 플랫폼에서 이미징 단계로 마우스를 전송합니다.
인트라바이탈 이미징을 수행하려면 췌장 이미징 창에서 췌장의 전체 보기를 스캔하기 위해 췌장 내 의 전체 보기를 4 번 과 같은 낮은 배율로 배반하는 것으로 시작합니다. 관심 영역이 결정되면, 20배 또는 40회 와 같은 더 높은 배율 목표 렌즈로 전환하여 각각 약 0.5 마이크로미터 및 3 마이크로미터의 측면 및 축 분해능으로 세포 수준 이미징을 수행합니다. 세포 이동과 같은 3D 구조 또는 세포 수준 역학을 관찰하기 위해 Z 스택 또는 시간 경과 이미징을 수행합니다.
췌장 내 인트라바이탈 이미징 창과 결합된 인트라바이탈 현미경 검사는 고해상도 이미징을 획득하여 최대 3주 동안 개별 섬을 추적할 수 있는 장기 조직 안정성을 제공합니다. 정맥 주사 방지 CD31 항체를 가진 C57 블랙 6 N 마우스에 이식된 창은 Alexa 647 형광호와 결합되어 췌장의 넓은 영역 이미징및 확대된 3D 이미징을 용이하게 합니다. 아시나르 세포는 인접한 혈관에서 췌장 조직의 평균 된 이미지에서 확인되었으며, 각각 자가 형광 및 항 CD31 항체를 사용하여 시각화되었다.
넓은 시야와 고해상도 이미징을 결합한 모자이크 이미징 방법을 사용하여 약 40~50개의 섬과 인접한 혈관분과 함께 MIP-GFP 마우스로 시각화하였다. 이전 연구는 이 안정적인 화상 진찰 방법을 사용하여 섬이 최대 3 주 동안 추적될 수 있다는 것을 보여주었습니다. 암세포를 시각화하기 위해 PANC-1 누클레트 적세포는 수술 중 마우스 췌장에 직접 이식되었고 인근 혈관은 Alexa 647과 접합된 항 CD31로 염색하였다.
이 프로토콜을 사용하여 췌장암의 넓은 필드 이미지가 생성되었습니다. 이것은 종양의 여백을 묘사하고 단하나 세포 수준에서 고해상도 3D 심상을 달성하는 데 도움이되었습니다. 이 방법의 가장 중요한 단계는 마우스에 있는 췌장 화상 진찰 창의 숙련된 이식입니다.
형광 마우스 세포의 다른 조합을 사용하여, 항체 프로브, 섬 또는 취소 세포를 가진 가까운 세포의 동적 상호 작용을 확인할 수 있었다. 이 방법은 다양한 병리학 적 조건및 구내췌장의 미세 환경에서 이슬레의 변화를 탐구하는 사람들에 의해 널리 적용될 수 있다.
