يصف هذا البروتوكول المستوى الخلوي المستقر والمتكرر في تصوير الجسم الحي للبنكرياس مع نافذة تصوير البنكرياس داخل الجسم. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه من الممكن إجراء تصوير ثلاثي الأبعاد بلا حراك بدقة تصل إلى المستوى الخلوي على مدى ثلاثة أسابيع في البنكرياس من فأر حي. ابدأ بإعداد المنصة الجراحية وتطهير الأسطح بالإيثانول بنسبة 70٪.
بعد تخدير, استخدام مسبار المستقيم مع لوحة التدفئة التي تسيطر عليها homeothermic لمراقبة درجة حرارة الجسم. إزالة الشعر من الجناح الأيسر من الماوس وتطبيق الكحول واليود بدلا من ذلك، بالتناوب من موقع شق إلى السطح الخارجي، أبدا العودة إلى موقع شق، وتنتهي مع اليود. ثم، إجراء شق 1.5 سم على الجناح الأيسر من الماوس، تشريح الجلد والعضلات.
استخدام أسود أو النايلون 4-0 خياطة لأداء خياطة سلسلة محفظة في هامش شق. سحب الطحال بعناية مع ملقط حلقة وتحديد البنكرياس. وضع النافذة في الجناح من الماوس، وتمرير الطحال والبنكرياس من خلال الفضاء المفتوح للنافذة.
ثم ضع البنكرياس برفق على لوحة نافذة التصوير أثناء وضع الطحال على المساحة المفتوحة للنافذة. حقن بانك-1 nuclite الأحمر مباشرة في البنكرياس. استخدم إبرة قسطرة قياس 31 لتطبيق قطرات من الغراء n-Butyl cyanoacrylate على هامش نافذة التصوير، مما يضمن تطبيق الحد الأدنى من الغراء.
ضعي بلطف زجاج غطاء دائري عيار 12 ملليمترا على هامش نافذة التصوير. ثم، عقد حلقة خياطة لتناسب الأخدود الجانبي للنافذة وربطه ثلاث مرات. وأخيرا ، لمنع انقطاع هذه الغرز الضيقة عندما تكون الفئران مستيقظة ، اقطع أقصى موقع قريب من ربطة العنق.
ابدأ بتشغيل المجهر داخل الحتمية، بما في ذلك قوة الليزر. لإدخال قسطرة وعائية، ضع ضغطا على الجانب القريب من الذيل باستخدام الفهرس والإصبع الثالث. إذا لزم الأمر تسخين الذيل مع مصباح.
تطهير الوريد الذيل مع رذاذ الإيثانول 70٪، ثم إدراج قسطرة قياس 30 في الوريد الذيل الجانبي وتصور قلس الدم في أنبوب PE-10. ضعي شريط حرير على القسطرة لتثبيته. حقن فيتك dextran و TMR dextran، أو غيرها من المسابير الفلورية حسب الاقتضاء، وفقا لمزيج من المسابير الفلورية.
أدخل مسبار المستقيم للتحكم تلقائيا في درجة حرارة الجسم باستخدام نظام لوحة التدفئة المنزلية. ثم أدخل نافذة تصوير البنكرياس المعدة أثناء إعداد المجهر داخل الجسم في حامل النافذة. نقل الماوس من منصة جراحية إلى مرحلة التصوير.
لإجراء التصوير داخل الجسم، ابدأ بتصوير البنكرياس عند تكبير منخفض، مثل أربع مرات، لمسح المنظر الكامل للبنكرياس في نافذة تصوير البنكرياس. وبمجرد تحديد المنطقة ذات الاهتمام، انتقل إلى عدسة هدف تكبير أعلى، مثل 20 مرة أو 40 مرة، لإجراء التصوير على المستوى الخلوي بدقة محورية وماكسية تبلغ حوالي 0.5 ميكرومتر و3 ميكرومترات على التوالي. إجراء Z-المكدس أو التصوير الفاصل الزمني لمراقبة البنية ثلاثية الأبعاد أو ديناميكيات المستوى الخلوي مثل هجرة الخلايا.
يوفر الفحص المجهري داخل الجسم إلى جانب نافذة التصوير داخل الجسم البنكرياسي استقرار الأنسجة على المدى الطويل الذي يمكن من الحصول على التصوير عالي الدقة لتتبع الجزر الفردية لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع. النافذة المزروعة في الماوس C57 الأسود 6 N مع الأجسام المضادة CD31 عن طريق الحقن عن طريق الوريد، وترافق مع الفلوروفور اليكسا 647، وسهلت التصوير واسعة النطاق وتضخيم التصوير ثلاثي الأبعاد للبنكرياس. تم تحديد خلايا Acinar في متوسط صور أنسجة البنكرياس في الأوعية الدموية المجاورة ، وتصور باستخدام autofluorescence والأجسام المضادة للCD31 على التوالي.
وباستخدام طريقة تصوير الفسيفساء، التي تجمع بين منظر واسع المجال والتصوير عالي الدقة، تم تصور ما يقرب من 40 إلى 50 جزيرة مع الأوعية المجاورة في فأر MIP-GFP. أظهرت دراسة سابقة أنه يمكن تتبع الجزر لمدة تصل إلى ثلاثة أسابيع باستخدام طريقة التصوير المستقرة هذه. لتصور الخلايا السرطانية، تم زرع الخلايا الحمراء النوكليت PANC-1 مباشرة في البنكرياس الماوس أثناء الجراحة والأوعية القريبة كانت ملطخة المضادة CD31 المقترنة مع اليكسا 647.
باستخدام هذا البروتوكول، تم إنشاء صور واسعة المجال لسرطان البنكرياس. وقد ساعد ذلك في تحديد هامش الورم، فضلا عن تحقيق صور ثلاثية الأبعاد عالية الدقة على مستوى الخلية الواحدة. الخطوة الأكثر أهمية في هذه الطريقة هي زرع ماهرا من نافذة تصوير البنكرياس في الماوس.
باستخدام مجموعات أخرى من خلايا الماوس الفلورية، ومسابير الأجسام المضادة، يمكن التعرف على التفاعل الديناميكي للخلايا القريبة مع الجزر أو إلغاء الخلايا. يمكن تطبيق هذه الطريقة على نطاق واسع من قبل أولئك الذين يستكشفون تغيير الجزيرة في مختلف الظروف المرضية والبيئات الدقيقة لسرطان البنكرياس في الموقع.
